| 携带人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒的构建和鉴定 |
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| 引用本文： | 黄宗强,刘尚礼,郑召民,沈慧勇,黄东生,崔力扬.携带人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒的构建和鉴定[J].中山大学学报(医学科学版),2004,25(1):45-51. |
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| 作者姓名： | 黄宗强 刘尚礼 郑召民 沈慧勇 黄东生 崔力扬 |
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| 作者单位： | 中山大学附属第二医院骨科,广东,广州,510120 |
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| 基金项目： | 广东省科技攻关项目，中山大学校科研和教改项目 |
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| 摘 要： | 目的] 采用 Cre-LoxP同源重组系统构建并鉴定携带人胰岛素样生长因子-1( human insulin-like growth factor-1, hIGF-1)目的基因的复制缺陷重组腺病毒,为椎间盘退变的 hIGF-1基因治疗奠定基础.方法] PCR合成 hIGF-1基因,用 pMD18-T载体克隆 hIGF-1目的基因,酶切、测序并进行 NCBI BLAST相似性在线分析.将 pMD18-T-hIGF-1和 pDNR-1r质粒分别行 EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切, DNA 连接酶连接双酶切产物,转化感受态大肠杆菌 DH5α,合成中间载体 pDNR-hIGF-1,酶切鉴定.Cre-loxP系统介导 pDNR-hIGF-1和 pInt.AV1.SpaT同源重组形成 pInt.AV1.SpaT-hIGF-1重组表达质粒,行 EcoRⅠ酶切鉴定.复苏 293细胞,将 pInt.AV1.SpaT-hIGF-1和 pInt.B.B质粒在 293细胞内进行同源重组成含 hIGF-1基因的复制缺陷重组腺病毒.倒置显微镜观察 293细胞病变样效应( cytopathogenic effect, CPE);透射电镜观察 293细胞中的病毒颗粒;提取细胞裂解液中病毒 DNA, PCR鉴定 hIGF-1目的基因的存在; Western blot 检测 hIGF-1蛋白表达.用半数组织培养感染量 (tissue culture infectious dose 50,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度.结果]克隆的 hIGF-1目的基因经 NCBI BLAST相似性在线分析证实与 Homo sapiens IGF-1 (GI:19923111)完全相同.pInt.AV1.SpaT-hIGF-1酶切鉴定,出现 5.4 kb和 1 kb两条片段,与理论值完全相符.转染 293细胞 12～ 14 d后,大部分细胞出现肿胀,脱落等细胞病变样效应.PCR鉴定细胞裂解液中含有 hIGF-1目的基因.Western blot 证实重组腺病毒表达 hIGF-1蛋白.第 2代腺病毒的滴度为 80× 106 PFU/mL.结论]成功构建出含有 hIGF-1目的基因的复制缺陷重组腺病毒.
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| 关 键 词： | 腺病毒 胰岛素样生长因子 克隆 分子 |
| 文章编号： | 1643-3554(2004)01-0045-07 |
| 修稿时间： | 2003年11月13 |
Construction and Identification of Adenovirus with Human Insulin-like Growth Factor-1 Gene |
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| HUANG Zong-qiang,LIU Shang-li,ZHENG Zhao-min,SHEN Hui-yong,HUANG Dong-sheng,GUI Li-yang.Construction and Identification of Adenovirus with Human Insulin-like Growth Factor-1 Gene[J].Journal of Sun Yatsen University(Medical Sciences),2004,25(1):45-51. |
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| Authors: | HUANG Zong-qiang LIU Shang-li ZHENG Zhao-min SHEN Hui-yong HUANG Dong-sheng GUI Li-yang |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | adenovirus insulin-like growth factor-1 cloning molecular |
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