两种不同消化方法对表皮细胞表面抗原α6整合素和转铁蛋白受体表达的干预

目的：采用单纯胰酶和中性蛋白酶联合胰酶两种不同的消化方式，观察表皮细胞表面抗原α6整合素和转铁蛋白受体CD71表达的变化，为荧光激活细胞分选术分选表皮干细胞选择合适的消化方法。方法：选取中山大学附属第一医院外科门诊包皮环切手术患者的皮肤标本10份，患者均知情同意，年龄14～22岁。每份标本均分为2份，分别用胰酶、中性蛋白酶联合胰酶进行消化，共20份，分为胰酶组、中性蛋白酶联合胰酶组，10份／组。胰酶组将皮条放入质量浓度为2．5g／L的胰酶中，4℃消化过夜。次日撕除表皮角质层，以弯镊轻刮皮肤上皮面，获得表皮基底层细胞；电性蛋白酶联合胰酶组将皮条放入质量浓度为2．5g／L的中性蛋白酶中,4℃消化过夜。次日轻撕下皮肤表皮层，将其剪成1mm&;#215;1mm大小的碎块，以质量浓度为2．5g／L的胰酶消化5min，获得表皮基底层细胞。分别取两组细胞悬液300μL，加入碘化丙啶标记死亡细胞，流式细胞仪检测死亡细胞百分率，计算细胞活力。以荧光标记的毗整合素和CD71抗体标记细胞表面抗原，通过流式细胞术检测抗原表达。剩余细胞以表皮细胞培养液重悬，移入预先铺有100mg／L Ⅳ型胶原的培养瓶中，接种密度为5&;#215;10^4／cm^2，3d换液1次，观察两组细胞的生长情况。结果：实验纳入包皮环切手术患者的皮肤标本10份，每份标本分别用胰酶、中性蛋白酶联合胰酶进行消化，共20份，全部进入结果分析。①不同酶消化后两组细胞活力的比较：中性蛋白酶联合胰酶组细胞活力明显高于胰酶组[（86&;#177;1．81）％，（82&;#177;1．48）％，P〈0．01]。②不同酶消化后两组细胞抗原的表达：胰酶组时α6^bimCD71^bim细胞占（8．00&;#177;1．69）％，α6^bimCD71^bim细胞占（36．00&;#177;18．03）％，α6^bim细胞占（40．00&;#177;10．08）％；中性蛋白酶联合胰酶组3种细胞所占比例依次为（30．00&;#177;8．59），（8．00&;#177;1．63），（38．00&;#177;8．72）％，两组各抗原的表达基本相似（P〉0．05）。③不同酶消化后两组细胞形态学观察结果：胰酶组细胞贴壁及伸展较中性蛋白酶联合胰酶组稍迟0．5-1．0h，此后培养过程中生长增殖情况无明显差异，一般7d左右接近融合，传代。培养第7天，表皮细胞体积小，核浆比例大，可见夹杂有成纤维细胞。中性蛋白酶联合胰酶组细胞30min内基本贴壁，并有少量细胞伸展，60min后大部分细胞伸出短小伪足，胞质展开，折光率减低。培养第7天，表皮细胞体积小，核浆比例大，未见夹杂有成纤维细胞。结论：从对表面抗原表达影响的角度来看，单纯胰酶消化与中性蛋白酶联合胰酶消化后α6^bimCD71^bim，α6^bimCD71^bim，α6^bim这3种表皮细胞的检出率基本相似，两种消化方法可根据习惯选用。但中性蛋白酶联合胰酶消化对细胞活力影响小，消化时机容易掌握，对细胞损伤相对小，适用于荧光激活细胞分选术分选表皮干细胞。

Intervention of two different digestion methods on the expression of surface antigen alpha 6 integrin and transferrin receptor in epidermic cells