| 成骨诱导双基因共表达腺病毒载体的构建 |
| |
| 引用本文： | 徐绘华,郭奇峰,厉新妍,刘青华,向帅,娄盼.成骨诱导双基因共表达腺病毒载体的构建[J].中华显微外科杂志,2011,34(3). |
| |
| 作者姓名： | 徐绘华 郭奇峰 厉新妍 刘青华 向帅 娄盼 |
| |
| 作者单位： | 广州医学院附属广州市第一人民医院,广州,510180 |
| |
| 基金项目： | 广东省科技计划项目，广州市科技支撑计划项目，广州市医药卫生科技项目 |
| |
| 摘 要： | 目的 探讨用一条Link序列T2A连接骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因构建含目的 基因的腺病毒载体的可行性.方法 先从cDNA中扩增得到全长BMP-2和bFGF基因片段,再接于Link序列T2A的两端.通过T2A Peptide的互补.延伸得到BMP2-T2A-bFGF的全长PCR产物,利用上游引物的Bgl Ⅱ酶切位点和下游引物的EeoRV酶切位点将其插入到pShuttle-IRES载体中,酶切、测序鉴定;利用同源重组技术将目的 基因表达框从穿梭质粒转移到腺病毒载体,鉴定阳性克隆;将PacI线性化后的腺病毒载体转染到293A细胞,观察GFP表达,PCR鉴定后进行大量扩增,并用CsCl梯度离心法进行纯化;测量A260,计算病毒感染滴度.结果 克隆得到的BMP-2与bFGF基因测序正确.经BglⅡ和EeoR Ⅴ双酶切得到的BMP2-bFGF 2个基因全长序列完全克隆到穿梭质粒和重组腺病毒载体质粒中;转染293A细胞2周后观察到明显的GFP聚集表达,即病毒包装成功,扩增纯化后滴度为3.6×1011 VP/ml.结论 经酶切鉴定BMP-2与bFGF双基因共表达腺病毒载体构建成功.
|
| 关 键 词： | 骨形态发生蛋白-2 碱性成纤维细胞生长因子 双基因共表达 T2A序列 腺病毒 |
| 本文献已被 万方数据 等数据库收录！ |
|
