人胰岛素原突变体重组逆转录病毒及稳定包装细胞系的构建和鉴定

目的　构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　采用PCR重叠延伸定点突变技术 ,将普通细胞内Furin蛋白酶的识别和切割位点Arg X Lys Arg 样序列 ,引入人胰岛素原C肽两端 ,同时加上信号肽、Kozak序列和酶切位点并克隆至逆转录病毒载体 pLXSN中 ,测序正确后转染包装细胞PA317,经G4 18筛选后挑选稳定生产病毒的细胞株 ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果　测序证明胰岛素原cDNA的 5个预定位点成功突变 ,其上游加上了信号肽和增强表达的Kozak序列 ;G4 18筛选重组pL mPIN SN转染PA317细胞抗性克隆 ,其病毒滴度为 2 .6× 10 5CFU/ml,而且基因组PCR和病毒液的RT PCR都显示有 2 86bp的条带 ,提示构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论　成功构建了携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及包装细胞系 ,为进一步胰岛素基因治疗糖尿病的实验研究奠定了基础

Construction and identification of recombinant defective retroviral vector with mutant human proinsulin gene and stable virus-producing cell lines