大鼠黏结蛋白聚糖1基因重组腺病毒载体的构建及感染效率

背景:重组腺病毒质粒的构建方法主要有体外连接法和同源重组法。同源重组法有操作复杂、耗时长、效率低、纯化难的缺点。体外连接法又不可避免非特异性的基因重组及基因突变。目的:应用改良体外连接法构建携带黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体,测定其在心肌成纤维细胞中的感染效率。设计、时间及地点:单一样本实验,于2007-08/2008-02在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。材料:穿梭载体pShuttle-CMV(含绿色荧光报告基因)和腺病毒骨架质粒pAdxsi购自诺赛基因组研究中心有限公司。方法:核苷酸序列鉴定pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒;用KpnⅠ XhoⅠ从质粒pCMV-Sport6.1-Sdc1切出黏结蛋白聚糖1基因片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,形成重组穿梭质粒。用I-CeuI I-SceI双酶切出重组穿梭质粒中CMV-Sdc1片段,亚克隆至腺病毒基因组质粒中,得到重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVSdc1,转化体外培养的心肌成纤维细胞。主要观察指标:用DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的滴度和感染效率。结果:①核苷酸序列分析表明,pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒正确携带大鼠黏结蛋白聚糖1cDNA;黏结蛋白聚糖1基因被克隆于载体pShuttle-CMV上,以KpnⅠ XhoⅠ双酶切可回收3kb的克隆片段和5.1kb的载体片段;重组腺病毒质粒用XhoⅠ酶切得到7个片段而空载体仅得到6个片段。②重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;提取病毒DNA行聚合酶链反应鉴定可扩增出1.13kb的特异性片段;用病毒上清多次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度检测达2.0×1011PFU/mL。③用纯化浓缩后的重组腺病毒以感染复数为100感染心肌成纤维细胞,24h后所有细胞均表达绿色荧光。结论:成功构建了携带大鼠黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体,经纯化浓缩后具有较高的滴度,能有效转染心肌成纤维细胞。

Construction and infection efficiency of recombinant adenovirus containing rat syndecan-1 gene