小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态★

目的：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。欲解决以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞为常规饲养层培养人胚胎干细胞时存在的问题，观察两者按一定比例制成的混合饲养层上人胚胎干细胞的生长状态。 方法：实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。①对象：包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕12.5~14.5 d的胎鼠11只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：将去除头、四肢和内脏的胎鼠按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素C处理2.0~3.0 h后，按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按1∶0，3∶1，1∶1， 1∶3，0∶1比例混合，然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。③实验评估：观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态。并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 结果：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较：生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于其他两种饲养层。②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较：小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞按1∶1混合时，人胚胎干细胞显著堆积生长，克隆边缘清晰、隆起明显且饱满，按1∶3混合时无明显变化，优于其余3种混合比例。③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测：碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性，分别在200~300 bp和300~400 bp处可见OCT-4和端粒酶 mRNA表达的特异性条带。④体外分化实验：能形成拟胚体，贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞。 结论：①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比，二者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养，获得更佳的克隆形态。②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好。

Growth state of human embryonic stem cells on mixed feeder layers with mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts at different ratios