小鼠DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统的建立及功能鉴定

目的 建立小鼠双特异性磷酸酶1(DUSPl)3’端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因表达系统,并对其进行功能鉴定.方法 提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板通过PCR扩增获得小鼠DUSP1 3'-UTR全长序列,酶切后克隆至pGL3-control载体荧光素酶编码基因的下游,获得重组载体LuDP,经PCR、限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定正确后与内参照质粒pRL-TK共转染NIH3T3细胞,48h后检测双荧光素酶报告基因的表达.将含有小鼠DUSP1 3’-UTR的荧光素酶表达模块与来源于pRL-TK质粒的RL表达模块克隆至pLenti6-TR质粒中,获得双荧光素酶报告基因表达载体LuDP/RL,将其与RNA结合蛋白HuR表达载体(pcDNA3.1-HuR-FLAG)、mmu-miR-101a分别共t转染NIH3T3细胞,检测双荧光素酶的活性,分析HuR、mmu-miR-101对荧光素酶基因表达活性的影响.结果 成功构建了双荧光素酶报告基因表达载体.小鼠DUSP1 mRNA 3'-UTR可显著下调与其相连的荧光素酶的表达活性(0.14±0.01倍,P＜0.01)；共转染HuR可上调荧光素酶的表达活性(1.40±0.20倍,P＜0.05),共转染mmu-miR-101a则可下调荧光素酶表达活性(0.57±0.18倍,P＜0.05).结论 成功构建了DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统,该系统可用于转录后调控元件对小鼠DUSP1基因表达的调控机制研究.

Construction of mouse DUSP1 3'-UTR dual luciferase reporter system and its function identification