RT-RAA联合CRISPR/Cas12a快速检测新型冠状病毒方法的建立与评价

摘要:目的建立一种基于反转录酶一重组酶介导等温核酸扩增技术( RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计RT-RAA 引物和CRISPR来源RNA( crRNA),优化检测体系中乙酸镁( MgAc)用量、RT-RAA反应温度和时间以及LbCas12a反应温度。以10°~ 10 copies/μL重组质粒和其他呼吸道病原体分别评估该方法灵敏度和特异性。采用RT-RAA-CRISPR/Cas1 2a法和RT-PCR法对70份临床标本进行平行检测,比较两种方法的符合率。结果优化后的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法可在37 C条件下50 min内完成SARS-CoV-2检测。荧光法检测灵敏度为10 copies/μL,侧流层析法为1x 102 copies/μL。该方法能特异检测SARS-CoV-2, 与其他呼吸道病原体无交叉反应。RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测70份临床标本的结果与RT-PCR 法完全一致,符合率为100%。结论建立的RT-RAA-CRISPR/Cas 12a法检测SARS-CoV-2快速、经济、灵敏度高、特异性强,无需昂贵仪器设备,可由经验不足的人员操作,为临床快速诊断和现场大规模筛查SARS-CoV-2提供了新的思路和方法。