骨髓基质细胞分化状态对腺病毒介导骨形态发生蛋白2表达效应的影响

目的:利用骨形态发生蛋白2腺病毒转染向成骨细胞分化的骨髓基质细胞,在体外观察骨形态发生蛋白2的表达量和反应成骨细胞特性的指标变化。方法:实验于2002-04/12在北京大学第三医院中心实验室进行。6周龄雄性BALB/c小鼠60只用于骨髓基质细胞提取,小鼠骨髓基质细胞分别用Dulbecco改良的Eagle培养基液和骨诱导培养基(含地塞米松10-8mol/L、L-抗坏血酸50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/LDulbecco改良的Eagle培养基液)培养。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞的碱性磷酸酶比活性的比较:取原代培养的骨髓基质细胞,分别加入转染指数25,50,100,200骨形态发生蛋白2腺病毒,以不加骨形态发生蛋白2腺病毒的骨髓基质细胞作为对照。6d后收集细胞,测定碱性磷酸酶活性。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较:实验分5组:骨髓基质细胞组,用Dulbecco改良的Eagle培养基培养9d;骨诱导培养3d组,骨诱导培养3d改用Dulbecco改良的Eagle培养基培养6d;骨诱导培养9d组,骨诱导培养9d;骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒组,骨诱导培养3d,加入转染指数50的骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d;骨形态发生蛋白2腺病毒组,用Dulbecco改良的Eagle培养基培养3d,加入同量骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d。收集细胞,测定碱性磷酸酶比活性。③骨形态发生蛋白2与骨桥蛋白检测:采用免疫组织化学染色与蛋白印迹方法。实验采用拉丁方设计。结果:应用骨诱导培养基或转染骨形态发生蛋白2腺病毒均使细胞碱性磷酸酶比活性明显增加(P<0.05)。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞碱性磷酸酶比活性的比较:骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=50)组碱性磷酸酶比活性显著高于骨髓基质细胞组和骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=25,100,200)组犤(7658.53±1600.32)比(1932.89±665.30),(4311.53±1108.89),(5360.90±1374.61),划内(2661.86±653.46)nkat/(g·L),P<0.01犦。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较:骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=50)组与骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=50)组差异无显著性(P>0.05),显著高于骨诱导培养3d组和骨诱导培养9d组(P<0.05)。③骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白检测结果:骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒组两指标表达量均最高。结论:单纯用诱导Dulbecco改良的Eagle培养基以及先诱导培养再加入骨形态发生蛋白2腺病毒均可促进骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化,但是骨髓基质细胞用骨诱导培养基作用3d再加入骨形态发生蛋白2腺病毒能分泌表达更多的骨形态发生蛋白2,从而提高了目的基因表达的效应。

Differentiation state of bone marrow stromal cells influences the expression of adenovirus mediated bone morphogenic protein