基于TLR3/TLR9介导巨噬细胞自噬/极化效应探讨血管软化丸抗AS的作用机制

目的:观察血管软化丸通过对TLR3的影响,调控PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而对巨噬细胞自噬产生影响,以及观察血管软化丸通过对TLR9的影响,调控下游NF-κB和IRF7信号途径,影响巨噬细胞M2/M1平衡,探讨血管软化丸抗动脉粥样硬化(AS)的分子机制。方法:体外实验,将巨噬细胞随机分为6组,即对照组(空白血清),血管软化丸高剂量组、血管软化丸中剂量组、血管软化丸低剂量组、ODN组(TLR9激动剂:ODN1826)、poly组(TLR3激动剂:poly(I:C))。体内实验,将ApoE~(-/-)小鼠分为6组,对照组(生理盐水,灌胃)血管软化丸高剂量组(浓度为3.456 g/mL),血管软化丸中剂量组(浓度为1.728 g/mL)、血管软化丸低剂量组(浓度为0.864 g/mL)、ODN组(ODN1826,腹腔注射)、poly组(poly(I:C),腹腔注射),腹腔注射每周两次,灌胃每日1次,连续给药8周后取材进行检测。观察血管软化丸含药血清和TLR9对巨噬细胞的极化状态的影响,对动脉斑块iNOS和CD206的表达的影响,对巨噬细胞(M1/M2)平衡相关炎症因子的影响和对巨噬细胞(M1/M2)平衡相关炎症因子的影响;采用ELISA法检测细胞分泌炎性因子相关水平,采用Western blot检测和RT-PCR法检测血管软化丸对主动脉斑块TLR9和TLR3及其下游信号分子表达的影响,观测指标:采用Western blot检测各组细胞TLR9的蛋白含量,及主动脉TLR9及其下游的分子MyD88,p-NF-κB和IRF7的蛋白含量;采用流式细胞术和免疫化学荧光检测各组细胞M1型和M2型的比例;采用RT-PCR和ELISA法检测各组细胞TNF-α的表达;采用RT-PCR和免疫荧光检测RAW264.7细胞和动脉斑块的M1型和M2型巨噬细胞的相关标志性因子和炎症因子;病理学检测验证血管软化丸抗动脉粥样硬化的疗效。结果:血管软化丸含药血清可以诱导巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞的标志CD206;中药组斑块中iNOS的荧光密度表现为低表达(P0.05),而斑块中CD206的荧光密度则表现为高表达(P0.05);血管软化丸含药血清调低IL-1β、iNOS、Ciita表达(P0.05),调高Ym1、Fizz1表达水平(P0.05);能够改善细胞分泌炎性因子IFN-γ和IL-10相关水平(P0.05);血管软化丸含药血清调低TLR9蛋白和TLR3蛋白表达水平(P0.05);血管软化丸含药血清调低TLR9下游信号MyD88、p-NF-κB、IRF7 mRNA表达水平(P0.05);血管软化丸含药血清调低TLR3下游信号LC3Ⅱ、Beclin、Akt、mTOR mRNA表达水平(P0.05)。结论:血管软化丸通过影响TLR9,调控下游NF-κB和IRF7信号途径,进而调节巨噬细胞M2/M1平衡;通过调控TLR3影响PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而调节巨噬细胞自噬,抑制动脉粥样硬化的发生发展。

Research of Mechanism in Vascular Softening Pills Anti-Atherosclerosis Based on TLR3/TLR9-mediated Autophagy/Polarization