甘草黄酮亚组分及甘草黄酮C对TNF-α致肠上皮屏障损伤的保护作用研究

目的 从甘草黄酮中筛选活性亚组分及黄酮单体，考察其对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的肠上皮屏障损伤的保护作用。方法 以硅胶柱色谱法制备甘草黄酮亚组分；体外培养肠上皮细胞IEC-6并以TNF-α诱导炎症反应，分别以甘草黄酮亚组分（20 μg·mL^–1）提前干预，CCK-8法检测正常细胞存活率，酶联免疫吸附分析（ELISA）检测炎症细胞白细胞介素-6（IL-6）分泌水平，获得活性亚组分；高效液相色谱法（HPLC）确认活性亚组分的主要成分，进而以TNF-α诱导的Caco-2单层细胞肠道屏障损伤模型分别考察活性亚组分GCH15（5、10、20 μg·mL^–1）和甘草黄酮C（LicoC，5、10、20 μmol·mL^–1）对肠道屏障的保护作用，ELISA检测IL-6和IL-8分泌水平，电阻仪检测单层细胞跨上皮电阻（TEER），以异硫氰酸荧光素-右旋糖酐（FD-40）相对通过水平评估细胞旁通透性，免疫印迹法（Western blot）检测闭合小环蛋白-1（ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）表达。结果 制备得到甘草黄酮亚组分GCH1~GCH20；GCH2、GCH4、GCH8、GCH15和GCH19 20 μg·mL^–1均可显著抑制IL-6分泌（P<0.05），且以GCH15的细胞毒性最小；通过HPLC确认了GCH15的主要成分是LicoC；以TNF-α刺激Caco-2细胞，可明显促进IL-6和IL-8分泌（P<0.01），降低TEER值（P<0.01），提高FD-40相对通过水平（P<0.01），下调ZO-1和Occludin表达（P<0.01），促进MLCK表达（P<0.01）。以GCH15和LicoC提前干预则可抑制IL-6和IL-8分泌（P<0.01），增加Caco-2单层细胞TEER值（P<0.01），降低FD-40相对通过水平（P<0.01），并呈一定的剂量相关性，说明两者可以逆转TNF-α引起的炎症反应及细胞屏障功能紊乱。Western blot结果表明，GCH15 20 μg·mL^–1和LicoC 20 μmol·mL^–1均能促进ZO-1和Occludin表达（P<0.05，P<0.01），抑制MLCK表达（P<0.01）。结论 GCH15和LicoC均可明显缓解TNF-α引起的Caco-2细胞炎症反应及屏障功能紊乱，两者对屏障功能的调节作用可能是通过调控MLCK通路，进而促进紧密连接蛋白表达实现的。