蛋白激酶Cδ失活对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响

目的 探讨短发夹RNA（shRNA）靶向沉默人蛋白激酶Cδ（PKCδ）对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响。方法 根据Genbank数据库中PKCδ序列，设计、合成互补并特异性编码其 shRNA序列（PKCδ-shRNA-1和PKCδ-shRNA-2），克隆至pRNA6-1-Neo质粒载体后采用Western blotting检测PKCδ蛋白水平，筛选抑制效果最好的shRNA片段转染骨肉瘤干细胞（转染组），设阴性对照组（转染shRNA无意义随机阴性对照序列）和空白对照组（不行转染处理）。采用噻唑蓝（MTT）法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率，流式细胞术检测各组转染后的细胞凋亡和细胞周期情况，实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达，采用Western blotting检测各组转染96 h后PI3K／Akt及Wnt／β-catenin信号通路中相关蛋白的水平。结果 转染PKCδ-shRNA-1和PKCδ-shRNA-2后PKCδ蛋白水平均降低（P＜0.05），且PKCδ-shRNA-1的抑制效果优于PKCδ-shRNA-2，故后续实验选择PKCδ-shRNA-1；与其余两组相比，转染组的增殖抑制率、凋亡率及促凋亡基因Bax、Bad的mRNA水平均升高，而Bcl-2水平降低，且在细胞周期上，G0／G1期细胞比例升高，但S期和G2／M期细胞比例均降低，以上差异均有统计学意义（P＜0.05）；转染组PI3K／Akt通路中的PTEN水平升高、Akt水平降低，Wnt／β-catenin通路中β-catenin、C-myc和Cyclin D1水平均降低（P＜0.05）。结论 通过shRNA抑制PKCδ基因表达可抑制骨肉瘤干细胞增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞，对PI3K／Akt和Wnt／β-catenin信号通路激活有一定抑制作用，可能对骨肉瘤的防治有一定价值。