SHV-4型ESBL在pET26b/BL(DE3)中的表达纯化及其特性研究

目的:表达SHV-4型超广谱β-内酰胺酶,对纯化的SHY-4酶进行特性研究.方法:将SHV-4基因克隆到pET26b表达质粒,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)构建工程菌,重组工程菌经摇瓶发酵后获得种子菌,种子菌转入发酵罐发酵,当菌体密度OD600为0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,于37℃培养6 h.培养液离心收获菌体沉淀,其超声裂解上清液进行Ni2 亲和层析,获取的SHV-4酶进行分子量、纯度、等电点、最适条件、米氏常数、催化常数等特性进行分析.结果:SDS-PAGE电泳,等电聚焦电泳及系列的酶动力学实验表明SHV-4酶分子量约为30 kD,纯度大于95%,等电点为7.9,最适pH值为6.0～8.0,最适温度为37℃,以头孢硝噻吩为底物测定的Km值为2.61×10-6 mol/L,Kcat为258 s,Kcat/Km为9.88×107 mol-1·s-1·vL.结论:重组的SHV-4酶初步满足制成商品酶的条件.