基质金属蛋白酶1组织抑制剂短发夹式RNA对肾小球系膜细胞凋亡及细胞外基质的影响

目的 构建靶向基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)的短发夹RNA(shRNA)表达载体，并观察其对大鼠肾小球系膜细胞的凋亡和细胞外基质分泌的影响。方法 构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP-1/TIMP-1 shRNA， 利用该载体介导两个TIMP-1 shRNA，分别为TIMP-1 shRNA1和TIMP-1 shRNA2。用荧光显微镜观察EGFP的表达。采用 RT-PCR和Western 印迹测定宿主细胞TIMP-1在基因和蛋白水平的沉默效果。用 ELISA检测细胞外基质成份的表达。以流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。 结果 (1)测序证实成功构建了针对TIMP-1的shRNA表达载体pEGFP-1/TIMP-1 shRNA；(2)荧光显微镜下，转染组细胞内均见绿色荧光；未转染组未见绿色荧光；(3)基因和蛋白水平的检测显示，与阴性对照组相比，TIMP-1 shRNA1组的TIMP-1明显受抑制(P < 0.05)，TIMP-1 shRNA2组抑制效果不明显；(4)ELISA结果显示， 正常对照组FN、Ⅳ型胶原蛋白和 LN的表达不随时间的延长而变化；未转染组和阴性对照组在高糖诱导下， FN、Ⅳ型胶原蛋白和 LN的表达随时间的延长而增加；48、72 h的shRNA1组、抗体组和反义组对 FN、Ⅳ型胶原蛋白、LN表达明显低于阴性对照组，以shRNA1组最明显；(5)流式细胞仪结果显示，高糖诱导的各组细胞凋亡率随时间的延长而升高。在同一时间点shRNA1组细胞的凋亡率最高，反义组细胞的凋亡率次之，48 h和72 h的shRNA1组细胞的凋亡率与其他各组比较， 差异有统计学意义(P < 0.05)。 结论 pEGFP-1介导的TIMP-1 shRNA1能更加有效的抑制大鼠肾小球系膜细胞中TIMP-1的表达，促进肾小球系膜细胞的凋亡并使细胞外基质的成份表达下降。

Effects of TIMP-1 shRNA on the apoptosis of mesangial cells and the extracellular matrix in rat glomeruli in vitro