反义bcl-2基因抗白血病作用的研究

目的 研究反义bcl-2基因抗白血病作用及其特点，探讨反义基因或联合药物体外净化和治疗白血病可行性。方法 （1）RT－PCR和蛋白印迹方法检测HL－60、U937、K562、CEM白血病细胞株以及常见白血病类型的bcl-2 mRNA和P26蛋白表达情况。（2）选择高表达bcl-2基因的HL－60细胞株作为靶细胞，用人工合成bcl-2正反义硫代寡聚脱氧核苷酸（PS－ODN）体外培养处理。检测bcl-2 mRNA和P26蛋白的变化；DNA梯形分析细胞凋亡，锥虫蓝拒染法和克隆培养观察细胞生长；同时将HL－60细胞与PS－ODN培养孵育7天后的活细胞腹腔接种Scid鼠，半巢式RT－PCR和病理分析该HL－60细胞在体内生物学行为改变。（3）建立三种白血病细胞株CEM、K562、HL－60 Scid鼠白血病模型和有效监测与追踪白血病细胞株的方法，掌握体内白血病细胞株生物学行为；用bcl-2正反义PS－ODN腹腔给药治疗HL－60 Scid鼠白血病模型，观察治疗后体内白血病进展变化。（4）用RT－PCR方法克隆bcl-2基因和构建其两种不同的反义RNA逆转录病毒表达载体。（5）转染高表达bcl-2的HL－60细胞，比较两种反义RNA在对抗bcl-2的作用与降低内源性bcl-2蛋白水平上的异同性。观察两种反义RNA介导的靶基因抑制对烷化溶血磷脂（ALP）和四种化疗药物诱导的HL－60细胞凋亡的影响。（6）RT－PCR检测基因转染HL－60在化疗药物作用下FGFβ1表达。结果 （1）白血病细胞株表达bcl-2有差异，bcl-2 mRNA和它的P26蛋白不平行。（2）三种白血病细胞株HL－60，K562，CEM可在Scid鼠增殖，产生典型白血病浸润模型特征，白血病增殖和浸润程度与白血病细胞生物特性有关，其顺序为CEM＞K562＞HL－60。（3）人工合成的bcl-2反义硫化寡脱氧核苷酸（ASPO）能够下调HL－60细胞bcl-2表达，诱导凋亡，抑制增殖和克隆形成；同时使其失去在体内的致白血病能力。（4）bcl-2反义硫代寡脱氧核苷酸，腹腔给药能够抑制肿块增长，白血病扩张，延长Scid鼠生存期，呈剂量依赖性。（5）部分编码区的反义RNA能够降低HL－60细胞内源性Bcl-2蛋白水平，提高ALP和四种化疗药物对HL－60杀伤率，促进它们诱导的HL－60细胞凋亡。（6）反义基因转染的HL－60细胞在化疗药物作用下负调控因子TGFβ1基因表达增加。结论 bcl-2反义基因可有效对抗bcl-2原癌基因表达，发挥明显的抗白血病作用，为体外净化白血病细胞和体内治疗白血病提供依据。