基于代谢组学的四逆汤中附子-干姜药对配伍前后毒效变化规律分析

目的 探讨附子干姜配伍前后的毒效变化规律,揭示二者配伍内涵。方法 将60只SD大鼠随机分为空白组、空白-附子组、空白-附子干姜组、模型组、模型-附子组、模型-附子干姜组,后3组采用尾静脉注射阿霉素复制心力衰竭大鼠模型,前3组尾静脉注射等量生理盐水,并对比分析附子单煎液与附子干姜合煎液对正常大鼠与模型大鼠生化指标、心肌组织病理学形态的影响;对大鼠血清样品进行代谢组学分析,运用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）筛选组间差异代谢物,并分析差异代谢通路;结合网络药理学筛选附子干姜配伍前后与增强抗心衰药效、调控心脏毒性相关的代谢物及其关联靶点、通路,采用蛋白免疫印迹法（Western blot）对筛选出的代表性通路进行验证。结果 与空白组比较,模型组脑钠肽（BNP）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌钙蛋白（cTn）-T含量显著升高（P<0.01）,空白-附子组CK、LDH、cTn-T含量明显升高（P<0.05,P<0.01）,空白-附子干姜组CK含量显著升高（P<0.01）;与空白-附子组比较,空白-附子干姜组LDH含量明显降低（P<0.05）,病理切片显示2种煎液均可导致正常大鼠心肌组织病理损伤。与模型组比较,模型-附子干姜组BNP、CK、LDH、cTn-T含量明显降低（P<0.05,P<0.01）,模型-附子组BNP、LDH、cTn-T含量明显降低（P<0.05,P<0.01）;与模型-附子组比较,模型-附子干姜组CK含量显著降低（P<0.01）,2种煎液均可改善模型大鼠心肌组织病理学形态。代谢组学结果显示,附子单煎液与附子干姜合煎液分别可回调模型大鼠422种与459种代谢物,附子干姜合煎液对正常大鼠的代谢干扰作用弱于附子单煎液。网络药理学关联分析结果显示,干姜增强附子抗心衰药效方面,脱氧尿苷酸等3个代谢物关联到56个代谢物,82个靶点,13条通路,包括钙信号通路、肾素分泌、肾素-血管紧张素系统等;干姜影响附子心脏毒性方面,酪醇等3个代谢物关联到24个代谢物,55个靶点,14条通路,包括心肌细胞肾上腺素能信号转导、碳代谢等。Western blot验证实验结果显示,与空白组比较,模型组大鼠心肌组织中血管紧张素转换酶（ACE）、血管紧张素转换酶2（ACE2）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）表达显著升高（P<0.01）;与模型组比较,模型-附子组、模型-附子干姜组ACE、ACE2、AngⅡ表达显著降低（P<0.01）,与模型-附子组比较,模型-附子干姜组ACE2、AngⅡ表达显著降低（P<0.01）;与空白组比较,空白-附子组、空白-附子干姜组细胞外信号调节激酶（ERK）、蛋白激酶B（Akt）、cTn-I3表达显著升高（P<0.01）,与空白-附子组比较,空白-附子干姜组ERK、Akt、cTn-I3表达降低,但差异无统计学意义。结论 附子-干姜药对在病理状态下表现出一定程度的配伍增效关系,在正常生理状态下表现出一定程度的配伍减毒关系,二者的药效特征、配伍实质与机体生理状态密切相关。