PKG抑制剂KT-5823对宫颈癌HeLa细胞活力、凋亡、自噬的影响

目的:明确宫颈癌HeLa细胞对环鸟苷酸依赖性蛋白激酶（PKG）抑制剂KT-5823的敏感性，探究KT-5823对HeLa细胞活力、凋亡和自噬的影响及机制。方法:使用不同浓度的KT-5823干预HeLa细胞24h，CCK-8、免疫印迹试验分别测定细胞活力、PKG1表达水平，进而确定后续药物刺激浓度。将HeLa细胞分为两组，即DMSO组（对照组）和KT-5823组（实验组），流式细胞术检测细胞凋亡，GFP-LC3B荧光斑点实验检测自噬斑点形成数量，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测PKG1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、Beclin1mRNA的表达水平，免疫印迹试验检测PKG1、自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、自噬相关通路蛋白蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）蛋白的表达水平。增加自噬抑制剂SBI-0206965组观察自噬在此过程中的作用。结果:与对照组相比，实验组在3～100μmol/L刺激浓度下均可导致HeLa细胞活力降低（t=10.23～14.83，均P＜0.05），PKG1蛋白表达水平逐渐降低（t=10.01～14.17，均P＜0.05）。最终选取3μmol/L为刺激浓度，用于后续研究。与对照组相比，细胞凋亡增加（t=10.78，P=0.004），荧光自噬斑点数量增加（t=10.12，P=0.0005），PKG1mRNA、蛋白的表达水平降低（t=13.56，P=0.0002；t=5.461，P=0.0055）、LC3Ⅱ、Beclin1mRNA（t=8.359，P=0.0011；t=5.782，P=0.0044）、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白（t=6.924，P=0.0023；t=11.84，P=0.0003）的表达水平增加，p-Akt/Akt（t=5.194，P=0.0065）、p-mTOR/mTOR（t=12.78，P=0.0002）、Bcl-2/Bax（t=13.79，P=0.0002）的比值降低，Caspase3表达增加（t=9.341，P=0.0007）。与实验组相比，30、50、70、100μmol/L自噬抑制剂SBI-0206965组可增加细胞凋亡（t=7.616，P=0.0016；t=15.43，P=0.0001；t=11.01，P=0.0004；t=15.39，P=0.0001）。结论:PKG抑制剂KT-5823可有效抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡，同时可抑制Akt-mTOR通路诱导细胞发生自噬，且KT-5823诱导的自噬在此过程中起保护性作用，PKG可成为宫颈癌临床治疗的新靶点。