成人外周血单个核细胞体外培养过程中分化为早及晚期内皮祖细胞生物学表征

目的:观察成人外周血来源的单个核细胞在体外培养过程中形态、增殖能力和表面抗原的变化。方法:实验于2006-08/2007-02在广州南方医院完成。①实验材料:健康志愿者肘静脉血20份,年龄20～26岁,对本实验均知情同意。②实验方法:密度梯度离心健康成人肘静脉血得到单个核细胞,以(2～3)×106/cm2的密度接种于人纤维连接蛋白包被的6孔板,在含有人血管内皮细胞生长因子的M199培养基中进行培养,第4天首次换液,后每3d换液一次。③实验评估:第3天起观察细胞的形态及数量,分别对培养至第7,21天的贴壁细胞行流式细胞学分析及免疫组化染色检查。结果:①培养细胞的形态学观察:外周血来源单个核细胞接种后约有1/20贴壁,第4天左右可形成从中心向外放射的典型细胞集落,第7天有大量长梭形、双极针样细胞生长。培养第2周长梭形细胞开始凋亡,数量减少,同时出现大量椭圆形鹅卵石样细胞。至第3周鹅卵石样细胞已占据生长优势且增殖旺盛,长梭形细胞基本消失。②内皮祖细胞表面标志的变化:原代培养第7天,贴壁细胞表达与单核巨噬细胞系相关的表面抗原CD44(96.3%)、CD45(83.9%)、CD11c(63.7%)、CD14(11.9%),弱表达内皮细胞相关抗原flk-1(18.2%)、CD31(6.7%)、vWF(3.6%);第21天CD44表达下降至57.6%,而内皮细胞相关抗原CD31表达增加至67.2%,vWF增加至14.2%;造血干细胞相关抗原CD34始终呈阴性表达。免疫组化染色结果与流式细胞分析结果一致。结论:成人外周血中存在两种不同类型的血管内皮前体细胞,单个核细胞贴壁培养4～7d左右出现早期内皮祖细胞,2～3周时出现晚期内皮祖细胞。二者的外形、增殖潜能、表面抗原表达均不同。晚期内皮祖细胞是更好的种子细胞来源。

Biological characteristics of adult peripheral blood mononuclear cells differentiating into early and late endothelial progenitor cells in vitro