生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景：生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子，在诱导软骨形成，促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用。 目的：小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+)/生长分化因子5，检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成。 材料：雄性昆明种小鼠20只，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。生长分化因子5真核表达质粒pcDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备。 方法：全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞，取传至第3代细胞接种到6孔板，在细胞生长到90%融合时开始转染。设立3组：转染组采用LipofectamineTM2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染；空质粒组转染空质粒pcDNA 3.1(+)；空白对照组只加入等量脂质体，其余步骤相同。 主要观察指标：转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功，同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达，转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达。 结果：转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带，骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色；而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录，无特异性扩增条带，且细胞胞浆未见明显染色。转染组可检测到Ⅱ型胶原基因的表达，基因大小225 bp，Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色；空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达，SP染色均无明显染色。阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染，空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色。 结论：pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达，促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化。

Mouse bone marrow stroma stem cells transfected by growth differentiation factor 5 eukaryotic expression plasmid induces chondrogenic differentiation in vitro