| 摘 要： | 目的 在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)体内构建外源基因以及自身基因的过表达系统。方法 以绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,通过同源重组基因敲入和穿梭质粒两种方法构建Hp中基因过表达体系。同源重组法:以预先构建的基因敲除载体pSJHK的衍生质粒pSJHK4为载体,构建gfp基因敲入质粒pSJHK4-gfp,使用Hp鞭毛高表达基因flaA的启动子调控gfp的表达;以hp0547基因区域为插入位点,通过自然转化的方式将质粒转入细菌,胞内通过同源重组将gfp插入到Hp基因组中,荧光显微镜观察gfp表达的荧光情况。穿梭质粒法:将含有鞭毛基因flaA启动子和gfp基因的表达盒连入H.pylori-E.coli穿梭质粒pCHFHP中,构建表达质粒pCHFHP-gfp,自然转化到Hp中,荧光显微镜观察gfp表达的荧光情况。用同样方法构建Hp CagA蛋白(融合有His-tag)的表达质粒pCHFHP-CagA,转入预先构建的Hp CagA敲除株,通过亲和层析纯化重组蛋白,Western blot检测CagA的表达情况。结果 构建了gfp基因敲入质粒pSJHK4-gfp,转入Hp后细菌发出绿色荧光;基于穿梭质粒构建了gfp基因表达质粒pCHFHP-gfp,转入Hp中细菌同样发出荧光;进一步构建了CagA的表达质粒并转入Hp CagA敲除株中,Western blot检测到CagA蛋白,并体外纯化获得一定量蛋白。结论 基于同源重组基因敲入和穿梭质粒的方法可在Hp中构建外源基因及Hp自体基因的过表达体系,该方法能够为Hp的基因功能研究和致病因子的发掘提供基因操作工具。
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