维生素D受体特异性siRNA表达载体的构建

目的通过构建维生素D受体（VDR）基因特异性siRNA（small interfering RNA）真核表达载体,检测其对血管内皮细胞（EC）中VDR基因的沉默作用,为进一步探讨VDR与心血管疾病发生发展关系的研究奠定基础。方法构建小鼠VDR特异性siRNA表达载体并测序,进行人EC/鼠EC的培养,进行siRNA转染试验,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率,Western blot进行鉴定。结果针对VDR基因的4个不同位点,设计、构建了4个siRNA干扰载体,经测序,序列全部正确。成功完成了人EC/鼠EC的培养及转染,荧光显微镜观察发现转染的重组质粒在EC内出现不同的转染效率,1号质粒的转染效率约为65%,2号质粒的转染效率约为50%,3、4号质粒的转染效率比较低。取转染效率较高的1、2号质粒做进一步转染干预,转染72h后,采用Western blot方法检测人EC/鼠EC内VDR蛋白质表达,与空白对照组比较1,、2号质粒在人EC中对VDR的表达无明显抑制作用,而在鼠EC中则有明显抑制作用,其中以1号质粒抑制效果最为明显,目的蛋白IOD/内参蛋白IOD比值发现两干扰组在人EC中对VDR的表达无明显抑制作用,而在鼠EC中则有明显抑制作用,其中以1号干扰质粒抑制效果最明显,抑制率达到了70%。结论成功完成了人EC/鼠EC的培养、转染及转染干预,并行Western blot鉴定,发现抑制效率明显的为鼠EC 1号质粒组。表明针对鼠VDR基因的siRNA表达载体有很强的特异性,并且对VDR基因干扰的位点不同表现的抑制效应不一。

Identification of human vascular endothelial cells/rat vascular endothelial cells transfected with vitamin D receptor gene in vitro

Aim To Identify of human/rat vascular endothelial cells transfected with vitamin D receptor gene in vitro.Methods The plasmid expression vector with human pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR was amplified in E.coli.The plasmid was extracted,purified by EndoFree Plasmid Maxi Kit.The plasmid of pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR was analyzed and identified by enzymes digestion and sequencing analysis.human vascular endothelial cells /rat vascular endothelial cells was cultured and transfected VDR gene were selected with G418.The expr...