| 摘 要： | 目的 构建人肿瘤抑制因子p53 结合蛋白2（tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2）的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F 细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2 蛋白并对其进行生物学活性鉴定。方法 利用UniProt 网站查询TP53BP2 基因序列,并进行Expi293F 表达系统序列优化,通过同源重组连接至pcDNA3.1(+)-P2AeGFP载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）将pcDNA3.1(+)-P2A-eGFPTP53BP2质粒瞬时转染至Expi293F 细胞,荧光显微镜观察转染效率,收集实验组及对照组细胞,利用免疫印记试验（Western blot,WB）检测TP53BP2 重组蛋白表达水平。通过His 标签纯化试剂盒及Superdex 200 10/300GL 层析柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE）对纯化后重组蛋白进行鉴定。利用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）检测重组人全长TP53BP2 蛋白与p65 蛋白结合情况。利用免疫荧光（immunofluorescence,IF）检测重组人全长TP53BP2 蛋白与p65 蛋白共定位。利用表面等离子体共振（surface-plasmon resonance,SPR）技术,检测纯化后的重组人全长TP53BP2 蛋白与TP53BP2抗体的相互作用。结果 经测序和双酶切鉴定,重组质粒pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2 构建成功。经荧光显微镜观察结果显示转染效率约为60%,WB 结果表明TP53BP2 蛋白在Expi293F 细胞中过表达,证明转染成功。SDS-PAGE结果表明纯化后重组蛋白纯度在90% 以上,证明纯化成功。Co-IP 结果表明,TP53BP2 重组蛋白可与p65 蛋白相互作用。IF 结果表明,His 标签蛋白、TP53BP2 蛋白及p65 蛋白存在共定位,表明三者之间存在相互作用。SPR 结果表明,纯化的重组人TP53BP 蛋白与TP53BP2 抗体具有较好的结合活性。以上结果均证明重组人全长TP53BP2 蛋白具有生物学活性。结论 成功构建了TP53BP2 基因真核表达载体并在人胚肾Expi293F 细胞中成功表达出具有生物学活性的重组人全长TP53BP2 蛋白,为进一步研究TP53BP2 的结构和功能奠定了基础。
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