通用型10-23脱氧核酶表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达

[目的]构建一种新型10-23脱氧核酶(Deoxyribozyme,DRz)的真核表达载体,并鉴定其在细胞内表达10-23DRz的能力. [方法]设计一条包含莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MLV-RT)引物结合序列、多克隆酶切位点及逆转录终止信号序列的寡脱氧核糖核苷酸ODN-PSL,并将其插入框架质粒pBUDCE4.1中PCMV的下游,获取重组质粒pBUD-PSL.通过二步亚克隆将MLV-RT的编码基因克隆至pBUD-PSL中另一启动子PEF-1α的下游,获取重组质粒pS-DE01.将pSDE01转染入巨噬细胞RAW264.7中,RT-PCR法鉴定MLV-RT的表达及逆转录酶活性.设计一taco基因特异性的10-23DRz-DZ1,并将其表达序列克隆入pSDE01中,获取重组表达载体pSDE01-DZ1.将pSDE01-DZ1转染入巨噬细胞RAW264.7中,分别经PCR和斑点杂交法检测DZ1在细胞内的表达. [结果]限制性内切酶酶切及测序结果显示pSDE01构建成功,将其转染入巨噬细胞RAW264.7后检测到了MLV-RT的表达,而且表达产物具有逆转录酶活性.pSDE01-DZ1转染入RAW264.7细胞后,经PCR和点杂交方法均检测到了DZ1的表达. [结论]成功构建了一种操作简便的通用型10-23DRz表达载体,该载体可在真核细胞内有效表达特异性10-23 DRz.

CONSTRUCTION AND IDENTIFICATION OF A GENERAL 10-23 DEOXYRIBOZYME EXPRESSION VECTOR