| 刚地弓形虫巨噬细胞迁移抑制因子基因敲除虫株的构建与鉴定 |
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| 作者姓名： | 王杰 温红阳 陈滢 安然 罗庆礼 沈继龙 都建 |
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| 作者单位： | 1. 安徽医科大学基础医学院生化与分子生物学教研室;2. 人畜共患病安徽高校省级重点实验室;3. 安徽医科大学基础医学院感染性疾病研究中心;4. 病原生物学安徽省重点实验室 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金（82072300,81871674,81902084）~~; |
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| 摘 要： | 目的 构建并鉴定刚地弓形虫RH株巨噬细胞迁移抑制因子(Tgmif)基因敲除虫株。方法 设计刚地弓形虫RH株Tgmif的单向导RNA (sgRNA)和点突变引物,将pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒定点突变为针对Tgmif基因的pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒。构建含有Tgmif上游1 001 bp (Tgmif-up)、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶基因(dhfr-ts)和Tgmif下游1 011 bp (Tgmif-down)等3个片段的Tgmif供体质粒,从Tgmif供体质粒PCR扩增获得Tgmif供体DNA。将pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒和Tgmif供体DNA混合后电击转染野生型刚地弓形虫RH株(RHWT)速殖子,用乙胺嘧啶培养7 d,筛选获得稳定表达乙胺嘧啶抗性的虫株并进行单克隆筛选,PCR扩增dhfr-ts上、下游同源臂和Tgmif鉴定Tgmif基因敲除单克隆株(RHΔTgmif)。提取RHΔTgmif和RHWT株虫体蛋白,蛋白质免疫...
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| 关 键 词： | 刚地弓形虫 巨噬细胞迁移抑制因子 基因敲除 |
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