NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子转录活性的影响

目的:构建含NADPH氧化酶1(NOX1)近端启动子区的pGL3萤光素酶报告基因载体及缺失NF-κB结合元件的相应载体,分别测定其相应活性,探讨NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子区转录活性的影响。方法:采用PCR法克隆NOX1启动子区序列（1415bp）,将目的片段与pGL3萤光素酶载体分别双酶切、纯化后进行连接（pGL3-NOX1-1415）,测序鉴定;应用Alibaba2.1软件分析NOX1近端启动子区,获取NF-κB结合元件;重叠PCR法将含该元件的启动子区域（88bp）缺失,并构建相应载体（pGL3-NOX1-1327）。将两载体分别与pRL-TK内参质粒瞬时转染进入A549细胞,采用TNF-α（10μg/L）刺激细胞24h,萤光酶标仪检测A549细胞的萤光素酶活性。结果:测序鉴定结果提示pGL3-NOX1-1415及NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327载体构建成功;细胞实验显示,TNF-α刺激后,转染pGL3-NOX1-1415的A549细胞萤光素酶活性明显强于对照组（P<0.05）,而转染NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327的细胞萤光素酶活性明显低于转染pGL3-NOX1-1415组（P<0.05）。结论:TNF-α诱导A549细胞NOX1基因活化与NF-κB密切相关,NF-κB参与了TNF-α诱导的NOX1基因启动子的转录调控。