大分子BAC基因打靶载体转染鸡胚原始生殖细胞

背景：利用原始生殖细胞技术可以方便地将各种外源基因转入鸡体内，以较快的速度获得转基因鸡，但到目前为止原始生殖细胞的转染效率仍然很低，且很难进行较大基因片段的转染。 目的：拟实现大分子BAC载体对鸡胚原始生殖细胞的转染。 设计、时间及地点：基因水平的细胞学体外观察，于2006-08/2008-07在广东省佛山大学完成。 材料：种蛋来自华南农业大学鸡场粤黄鸡群，受精蛋在37.5 ℃、相对湿度为65%的条件下孵化68~72 h。BAC-TDN-GID载体由佛山大学分子生物学实验室保存。 方法：以rRNA基因及其间隔序列作为同源重组引导序列，构建含GFP基因和hIFN基因的大分子BAC基因打靶载体，将鉴定为阳性的载体进行扩增培养并大量抽提。取课题组孵化至第19期的粤黄鸡胚，挑取其生殖嵴或性腺，胰酶消化法获得原始生殖细胞，并辅以饲养层和生长因子进行培养。采用脂质体介导法在原始生殖细胞内进行基因转移，对存活的细胞进行目的基因DNA水平和RNA水平鉴定。 结果：第19期鸡胚性腺原始生殖细胞体外培养48 h呈桑椹状或者椭圆状，72 h形成细胞集落，过碘酸染色呈紫红色。分子量达30 kb的大分子转基因载体BAC-TDN-GID转染鸡胚原始生殖细胞48 h可见荧光细胞，表明转染成功。经PCR和RT-PCR鉴定，证实扩增的产物大小与预期结果大致相吻合，目的基因hIFN已经整合进入原始生殖细胞基因组，并已开始表达。 结论：实验成功将大分子BAC载体上的外源基因转染入体外分离培养的鸡胚原始生殖细胞。

Macromolecule BAC targeting vector for transfection of chicken embryo primordial germ cells