体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮细胞的分化

目的:探讨体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮细胞分化的可行性。方法:实验于2004-10/2005-12在苏州大学儿科研究所和苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。骨髓间充质干细胞特性实验:①将2只4周龄SD大鼠断颈处死,无菌条件下取股骨、胫骨,去除其干骺端,暴露骨髓腔,DMEM培养液冲洗,混匀后用密度为1.077g/L淋巴细胞分离液分离。取单个核细胞层接种50mL细胞培养瓶进行培养,3d后首次换液,待10～14d细胞生长到80%～90%融合时以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化传代。②采用免疫荧光法测定骨髓间充质干细胞表面CD44与Vimentin的表达情况;应用二苯基四氮唑溴盐法检测细胞生长情况。损伤肾脏组织匀浆诱导骨髓间充质干细胞实验:①取1只成年SD大鼠麻醉后,表皮消毒,取腹部正中切口,寻及双侧肾蒂,用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂,缺血60min后松开动脉夹,再灌注60min后,无菌取肾制备匀浆。②将肾脏匀浆置于插入式嵌合培养皿中对第3代骨髓间充质干细胞进行诱导,并加入含有5μmol/L全反式维甲酸的最低必须培养基。③诱导第0,3,5,7天,倒置显微镜下观察细胞大体形态变化;以上各时间点取活细胞制成活细胞悬液,经流式细胞仪测定第18型角蛋白的阳性表达率;取诱导分化第7天的细胞,电镜观察其超微结构变化;钙钴法碱性磷酸酶细胞化学染色,与未经损伤肾脏组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞进行比较。结果:①骨髓间充质干细胞的特性检测:免疫荧光法鉴定分离培养的第3代细胞表面CD44和Vimentin表达阳性。二苯基四氮唑溴盐法测得的细胞生长曲线呈倒“S”型。②损伤肾脏组织匀浆诱导后骨髓间充质干细胞情况:骨髓间充质干细胞经诱导后大体形态变圆,由梭形细胞逐渐转变为鹅卵石样细胞,细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性。诱导第7天细胞出现微绒毛和紧密连接,经诱导后的骨髓间充质干细胞第18型角蛋白表达阳性率升至79.5%。结论:在缺血再灌注损伤大鼠肾脏匀浆及全反式维甲酸的联合诱导下,骨髓间充质干细胞可向肾小管上皮样细胞分化,具有成为种子细胞应用于急性肾脏损伤治疗的潜在价值。

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into renal tubular epithelial cells in vitro