应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg蛋白结合蛋白E36的上调基因

目的应用酵母双杂交及生物信息学(bioinformatics)技术获得HBeAg蛋白结合蛋白HBEBP36(E36),为了解该基因的反式调节机制,利用抑制性消减杂交技术筛选并克隆E36蛋白反式激活的靶基因。方法E36基因表达质粒pcDNA3·1/myc-his(A)(-)-E36转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3·1/myc-his(A)(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与pGEM-TEasy载体连接,构建cDNA消减文库,转化大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选30个克隆进行测序及同源性分析。结果成功构建人E36基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。随机挑选的30个克隆测序后得到27个序列,它们代表17种编码基因,包括ATP合酶、ADP/ATP转运体、NADH脱氢酶、乳酸脱氢酶、核糖体蛋白L23、核糖体蛋白S21、核糖体蛋白L2、胰岛素样生长因子结合蛋白6、甲基转移酶类似物7A、CD46抗原、间质抗原2、转录激活因子4、真核转录延伸因子1α、人微管蛋白α、肌动蛋白α,和2个未知片段。结论E36上调HepG2细胞中的17种基因,它们参与能量代谢、蛋白合成、免疫功能调节等生理过程。

Screening of the Target Genes Transactivated by Human Gene E36 Interacting with HBeAg Using Suppression Subtractive Hybridization Technique