旋毛虫海藻糖酶(TsTRE)蛋白的表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

目的 以原核表达的旋毛虫海藻糖酶(Trichinella spiralis trehalase, TsTRE)重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA抗体检测方法。方法 本实验采用RT-PCR技术扩增TsTRE基因,将其与pCold I表达质粒连接并于E.coli BL21感受态细胞中表达。应用亲和柱层析技术获得纯化rTsTRE,分别利用间接免疫荧光技术和Western-blot技术定位TsTRE和检测rTsTRE的免疫反应原性。与此同时,以rTsTRE蛋白为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法,并对其抗原包被浓度和待测血清稀释度、抗原包被条件、封闭液种类和封闭条件、酶标二抗稀释度和孵育条件、TMB显色时间等进行优化。确定该方法的临界值及评估该方法的重复性、敏感性、特异性和临床检出率等性能。结果 免疫荧光结果显示,在肌幼虫的杆状体、尾部和表皮等部位含有大量的海藻糖酶;Western-blot结果显示,rTsTRE可结合感染旋毛虫42 d小鼠的阳性血清且蛋白分子量约为60 kDa。建立的间接ELISA抗体检测方法的阳性临界值为0.384;批内和批间变异系数分别在5.504%～7.630...