CRISPR/Cas9 介导的PD-1基因敲除对食蟹猴T细胞增殖、表型及IFN-γ和IL-2 分泌的影响

目的：探讨CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除食蟹猴T细胞PD-1 基因对T细胞增殖、表型及IFN-γ、IL-2 分泌的影响。方法: 设计靶向食蟹猴PD-1 基因的gRNA，构建并提取质粒，分离食蟹猴外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC），加入质粒DNA，用Lonza 4D电转仪进行细胞转染，转染48 h 后用流式细胞术和荧光显微镜技术检测转染效率。提取细胞基因组DNA进行PCR扩增及T7E1 酶切鉴定。在人源性CD3 抗体和IL-2 刺激下诱导食蟹猴T细胞增殖并绘制细胞生长曲线，PI 染色流式细胞术检测T细胞的细胞周期及CD4、CD8 表达水平，ELISA检测IFN-γ、IL-2 的分泌水平。结果: 转染48 h 后，荧光显微镜下见实验组出现绿色荧光蛋白表达的细胞，其转染效率为（21.6±3.2）%；实验组细胞基因组DNA PCR产物经T7E1 酶切显示3 条带，出现目的分裂条带（243、197 bp）。与未转染组比较，（1）实验组T细胞增殖缓慢、集落形成时间延迟、细胞体积较小、折光性较弱；（2）实验组处于G0/G1 期的T 细胞数显著增多（P<0.05）、G2/M 期细胞数显著减少（P<0.05）；（3）实验组T 细胞IFN-γ、IL-2 的分泌水平显著升高（均P<0.05），但CD4、CD8 表达水平比较差异无统计学意义（均P>0.05）。结论: PD-1 基因敲除可使食蟹猴T细胞阻滞于G0/G1 期从而抑制其增殖，同时上调了IFN-γ、IL-2 的分泌水平。