人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT，并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段，与pGEM-T Easy连接，转化感受态大肠杆菌JM109，经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落，用EcoRⅠ酶切获取目的片段，并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接，重组子转化BL21感受态大肠杆菌，PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达，用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定，薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实，人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功，其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％，氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白，其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。