过表达葡萄糖调节蛋白78人乳腺癌细胞系HS578T、MDA-MB-231的构建

目的 构建过表达内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78,GRP78)的人乳腺癌细胞系HS578T、MDA-MB-231,为探讨GRP78在乳腺癌发生发展中的作用机制提供基础.方法 采用分子克隆技术构建表达GRP78的慢病毒载体pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro质粒,采用PCR法扩增质粒,后使用EcoRⅠ、NotⅠ限制性内切酶切割质粒,对酶切产物进行测序鉴定,成功构建pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro质粒.取对数生长期 293FT细胞系(克隆分离株),在培养皿中加入pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro混合液,培养48 h收集含GRP78慢病毒颗粒的上清液,保存备用.另取对数生长期人乳腺癌细胞系HS578T及MDA-MB-231,置于含GRP78慢病毒颗粒上清液的培养基中培养,培养48 h时在培养基中加入1∶500稀释嘌呤霉素,筛选GRP78过表达的HS578T、MDA-MB-231细胞系.加入嘌呤霉素培养48 h采用Western Blotting法检测HS578T、MDA-MB-231细胞GRP78.采用激光共聚焦显微镜对HS578T、MDA-MB-231细胞中GRP78蛋白进行定位.结果 构建表达 GRP78的慢病毒载体pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro质粒.GRP78过表达的HS578T、MDA-MB-231细胞系在78 kD左右可见明显GPR78蛋白电泳条带.HS578T细胞系中存在GRP78蛋白表达,主要分布在细胞质中.结论 成功构建GRP78过表达的MDA-MB-231、HS578T细胞系,GRP78主要表达于细胞质中.