乙型肝炎患者治疗前后外周血CD4+ CD25+ Tregs TCR CDR3 谱系漂移特征分析

目的:探讨AHB 患者急性期及恢复期、CHB 患者恩替卡韦治疗前后外周血PBMC 中CD4+ CD25+ Tregs TCR CDR3 谱系漂移特征的变化。方法:采集4 例正常人、3 例AHB 患者(急性期和恢复期)及4 例CHB 患者恩替卡韦治疗前后外周抗凝静脉血,分离外周血PBMC;磁珠分选法分选CD4+ CD25+ Tregs,提取总RNA,逆转录合成cDNA;根据TCR β链24 个可变区基因(TRBV)家族设计相应的上游引物,并在茁链恒定区(BC)设计一条共用的FAM 荧光标记下游引物及对照引物。PCR 扩增出24 个包含完整CDR3 区的TRBV 家族的PCR 产物,电泳鉴定目的片段; PCR 产物送上海基康用毛细管电泳法进行基因扫描;用Peak Scanner Software v1.0 软件分析研究对象TRBV 家族CDR3 谱系特征;采用配对t 检验(paired-sample ttest)检测AHB 患者急性期及恢复期、CHB 患者恩替卡韦治疗前后TRBV 家族谱系漂移率差异。结果:3 例AHB 患者急性期呈现普遍谱系漂移的TRBV4、10、14、16、19 家族在恢复期多转变为正态的多峰谱型,AHB 患者恢复期外周血CD4+ CD25+ Tregs TRBV 家族CDR3 谱型漂移率显著低于急性期(t =9.456,P =0.011);TRBV8、11、13.2、15、16、18、20 在3 例CHB 患者抗HBV治疗前出现克隆增生,TRBV1、5.2、6、12、14、24 在3 例CHB 患者抗HBV 治疗后出现克隆增生。CHB 患者抗病毒治疗后TRBV家族CDR3 谱型漂移率高于治疗前(t =-0.666,P =0.553)。结论:AHB 患者急性期呈现谱系漂移的TRBV4、10、14、16、19 家族在恢复期多转变为正态的多峰谱型,推测这种转变可能与HBsAg、HBeAg 转阴相关。CHB 患者在治疗前TRBV8、11、13.2、15、16、18、20 家族克隆增生的Tregs 可能通过下调机体的细胞免疫应答,阻碍病毒清除;随着药物导致病毒载量的显著下降,TRBV1、5.2、6、12、14、24 家族克隆增生的Tregs 可能更有助于诱导机体出现免疫耐受,导致HBV 不能彻底清除。

Spectrum drift characteristics of CD4+ CD25+ Tregs TCR CDR3 in hepatitis B patients before and after treatment