| 摘 要： | 目的：构建携带VP3基因重组腺病毒载体（pAdxsi-GFP-VP3）,探讨凋亡素（Apoptin）在人大细胞肺癌NCI-H460细胞中的表达及诱导凋亡效应。方法：以pcDNA3.1-VP3重组质粒为模板,经酶切将VP3基因连接至穿梭质粒,后转移至pAdxsi载体上,收获pAdxsi-GFP-VP3,经酶切和测序鉴定正确后进行病毒扩增和纯化,最后测定病毒滴度。将pAdxsi-GFP-VP3以最适感染复数转染入人大细胞肺癌NCI-H460细胞,利用RT-PCR（reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR）和West－ernblot技术检测Apoptin在细胞中的表达情况;透射电镜（transmissionelectronmicroscopy,TEM）下观察细胞的超微结构;MTT法检测细胞的增殖活性;流式细胞仪（flowcytometry,FCM）检测转染后细胞的凋亡率及细胞周期。结果：成功构建重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-VP3,经酶切与测序鉴定证实连接正确,病毒滴度可达1.6×109PFU/ml。RT-PCR显示转染48h后Apoptin的mRNA表达;Westernblot证实转染72h后Apoptin蛋白获得高表达。TEM观察发现NCI-H460细胞凋亡早期染色质聚集,线粒体固缩,凋亡中晚期出现凋亡小体等超微形态学改变。MTT法检测显示转染后的NCI-H460细胞增殖活性明显降低,呈时间依赖性（F=93.384,P=0.000）,与空病毒组和细胞对照组比较,差异有统计学意义（F=18.427,P=0.003）。FCM法检测显示Apoptin能有效地诱导NCI-H460细胞发生凋亡（F=47.307,P=0.000）,且凋亡率随时间呈逐渐上升趋势（F=303.237,P=0.000）;细胞周期表现为S期细胞比例降低（F=80.240,P=0.000）,G2/M期细胞比例增高（F=110.080,P=0.000）。结论：Apoptin可以有效地诱导人大细胞肺癌NCI-H460细胞发生凋亡,这为Apoptin临床应用于人非小细胞肺癌基因治疗的深入研究奠定实验基础。
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