建鲤重组Cystatin蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体制备

目的：对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPIs)Cystatin进行原核表达和纯化鉴定，并以重组Cystatin为抗原制备多克隆抗体。方法：用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转入pET-30a-Cystatin的E.coli BL21（DE3）表达重组蛋白，经过Ni2+-NTA镍离子亲和层析纯化重组Cystatin，高效液相色谱鉴定重组Cystatin的纯度，Azocasein法测定其对木瓜蛋白酶的抑制作用。利用QuickAntibody-Mouse5W快速佐剂和纯化的重组Cystatin免疫Balb/C小鼠获得抗血清，采用夹心ELISA法鉴定抗血清的效价，Western blotting和免疫组织化学法鉴定抗血清的抗原识别特异性。结果：原核表达的目的蛋白相对分子质量约20 000；镍亲和层析纯化后重组Cystain在SDS-PAGE上显示单一条带，纯度>95%；Azocasein法检测，0.014 μg重组Cystain抑制木瓜蛋白酶活性达50%以上；ELISA夹心法检测获得的Cystatin抗血清效价达到1∶512 000；Western blotting检测，转入pET-30a空质粒的全菌蛋白中未检测到Cystatin存在，而在转入pET-30a-Cystatin的全菌蛋白及纯化各步样品中均检测到Cystatin信号，且均为单一条带；免疫组织化学检测，建鲤各组织呈现不同强度的Cystatin阳性染色，抗血清中的多克隆抗体与原核和真核表达的Cystatin均特异性结合。结论：成功表达和纯化了建鲤Cystatin；获得含高效价多克隆抗体的Cystatin抗血清，具有高特异性和灵敏性。