SiO2 诱导巨噬细胞线粒体分裂在肺成纤维细胞活化中的作用

目的 探讨巨噬细胞线粒体过度分裂调控的核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含热蛋白结构域3(NLRP3)炎症小体激活在矽肺纤维化中的作用机制。方法 以不同浓度二氧化硅(SiO2)染毒大鼠肺巨噬细胞NR8383 12h,采用CCK8检测SiO2对NR8383 细胞存活率的影响;活细胞荧光探针法检测细胞活性氧(ROS)水平;ELISA法测定细胞上清液中白细胞介素-18(IL-18)、IL-1β和转化生长因子-β1(TGF-β1)的水平;Western blot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC)以及线粒体分裂蛋白Drp1的表达水平;Western blot法检测不同染毒时间点(0、12、24、48h)100 μg/ml SiO2 浓度下大鼠成纤维细胞 RFL-6COLⅢ、NLRP3、Drp1、α-SMA蛋白的表达水平;使用 Transwell小室将100 μg/ml SiO2处理过的NR8383细胞与RFL-6细胞进行共培养,检测不同处理时间点共培养上清液中IL-18、IL-1β和TGF-β1的水平及NR8383细胞NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、Drp1和RFL-6细胞COLⅢ、α-SMA的表达水平;使用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1(10 μmol/L)预处理共培养细胞,观察线粒体分裂抑制后对NR8383细胞NLRP3炎症小体激活、ROS 水平、TGF-β1释放水平及RFL-6细胞纤维化的影响。结果 随着SiO2染毒浓度增加,NR8383细胞存活率逐渐下降,确定100 μg/ml SiO2为最高染毒浓度;随SiO2染毒剂量的增加,NR8383细胞中ROS水平和细胞培养上清液中IL-18、IL-1β、TGF-β1水平明显增加(P<0.05);与对照组相比,100 μg/ml SiO2染毒后NR8383细胞NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC和Drp1蛋白表达显著增加(P<0.05);随着 SiO2染毒时间的增加,RFL-6细胞中COLⅢ、NLRP3、Drp1、α-SMA的表达水平无显著变化。在100 μg/ml SiO2染毒NR8383与RFL-6细胞共培养体系中,随着染毒时间的增加,NR8383细胞中ROS产生和上清液中IL-18、IL-1β、TGF-β1水平显著增加(P<0.05);与对照组相比,SiO2染毒24 h后NR8383细胞中NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC 及Drp1表达水平显著增加(P<0.05);RFL-6细胞中COLⅢ、α-SMA蛋白表达显著增加(P<0.05)。Mdivi-1可使SiO2处理的NR8383细胞中ROS和上清液中IL-18、IL-1β、TGF-β1水平的升高受到抑制(P<0.05),并下调NR8383细胞中NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、Drp1和RFL-6细胞中COLⅢ、α-SMA的蛋白表达(P<0.05)。结论 SiO2 可以促进大鼠肺巨噬细胞线粒体过度分裂、NLRP3炎症小体激活,进而诱导共培养体系大鼠成纤维细胞纤维化;抑制大鼠肺巨噬细胞线粒体过度分裂可以减轻NLRP3炎症小体活化,并抑制大鼠成纤维细胞纤维化,提示SiO2诱导肺巨噬细胞线粒体过度分裂可能是导致矽肺炎症过程和纤维化的重要原因。

Role of SiO2 induced mitochondrial division in the activation of pulmonary fibroblasts in macrophages