人ApoC-Ⅰ基因的克隆、原核表达与纯化

【目的】进行含信号肽ApoC-Ⅰ(signal-ApoC-Ⅰ)和ApoC-Ⅰ成熟肽(mature-ApoC-Ⅰ)的基因克隆、原核表达和纯化。【方法】取肝癌切除手术患者的癌旁组织,提取总RNA后,逆转录成c DNA,并设计带酶切位点的特异引物分别扩增出signal-Apo C-Ⅰ、mature-Apo C-Ⅰ基因;将扩增出的基因通过T克隆入PMDTM19-T载体;T克隆经测序验证后,双酶切出目的基因,连入同样双酶切后的PET28a载体,构建原核表达质粒;再次测序验证后,将质粒转入BL21Star(DE3)中,表达条件优化后进行融合表达;将表达后产物用Ni-NTA树脂亲和层析进行重组蛋白纯化;纯化产物采用Western blot进行验证。【结果】构建了PET28a-signal-ApoC-Ⅰ、PET28a-mature-Apo C-Ⅰ表达质粒,重组质粒都经过测序鉴定正确;PET28a-signalApoC-Ⅰ诱导表达后能抑制宿主菌生长,但经过条件优化2个表达质粒都在BL21Star(DE3)菌中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大量表达和纯化,Western blot证实了表达的结果。【结论】含信号肽ApoC-Ⅰ、ApoC-Ⅰ成熟肽的基因克隆、原核表达和纯化成功,为进一步研究重组人Apo C-Ⅰ的作用奠定了基础。