K562细胞分泌的exosome的免疫电镜研究

目的:通过免疫电镜方法观察K562细胞分泌的exosome,探讨其潜在的临床应用价值. 方法:采用离心超滤和蔗糖密度梯度离心等方法分离出K562细胞释放的exosome,经透射电镜观察其超微结构. 采用固相免疫电镜法(SPIEM)制备exosome的HSP70,ICAM-1及ABL免疫电镜标本. 结果:K562细胞分泌的exosome为直径50～100 nm的膜性微囊结构,圆形或椭圆形,腔内为低电子密度成分. 经抗HSP70,ICAM-1和ABL抗体-胶体金免疫电镜标记,囊外膜及腔内可见点状﹑颗粒状电子致密物沉积. 结论:离心超滤和蔗糖密度梯度离心法纯化小量exosome方法可行,K562细胞分泌的exosome表达HSP70,ICAM-1和ABL蛋白,具备免疫原性.  

小鼠肝癌细胞(H22)源外泌体的体内抗肝癌作用研究

目的在荷瘤动物模型观察小鼠肝癌细胞（H22）来源的外泌体（exosomes）激发宿主抗肝癌免疫应答的效应。方法用自行分离纯化的小鼠肝癌细胞H22源外泌体免疫小鼠，然后给小鼠皮下注射H22肿瘤细胞，观察肿瘤的生长状况。用MTT法检测小鼠脾细胞增殖情况和细胞毒活性；用免疫组织化学法检测肿瘤组织中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞浸润情况。结果该外泌体使肿瘤出现时间延迟，肿瘤生长缓慢，小鼠生存率提高。促进脾淋巴细胞增殖并增强其细胞毒活性，促进CD4^＋和CD^8＋T细胞活化。结论小鼠肝癌细胞（H22）源外泌体能诱导抗肿瘤应答，有效地诱导特异性的杀伤肿瘤细胞活性，有针对亲本细胞的免疫保护作用。  

肿瘤源性外切体负载的间充质干细胞抗肿瘤活性的实验研究

目的:分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体及同基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs);将外切体负载经γ干扰素(IFN-γ)刺激活化的间允质干细胞,探讨其抗肝癌细胞活性改变.方法:利用超滤及密度梯度离心法分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体;利用贴壁培养联合免疫磁珠阴性分选法体外培养同基因小鼠骨髓间充质干细胞;外切体负载活化的间充质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育,72 h后观察H22细胞增殖状态.结果:外切体负载的IFN-γ刺激活化的间允质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育72 h后,活化组H22细胞增殖速度明显低于对照组.结论:负载肿瘤源性外切体的间充质干细胞抗肝癌细胞活性明显增强,间充质干细胞联合肿瘤源性外切体有可能成为一种更为有效的外切体疫苗诱导抗肿瘤效应.  

以exosome为基础的肿瘤免疫治疗研究进展

exosome是由细胞分泌至细胞外的膜性小囊泡，表面含有大量与其来源和功能密切相关的蛋白质和脂质成分。如树突状细胞和肿瘤细胞分泌的exosome可同时表达主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ、Ⅱ分子、共刺激分子、热休克蛋白Hsp70—90和肿瘤抗原，在体内和体外实验中，能诱发和增强机体的免疫反应，表现出与抗原呈递细胞相似的功能。exosome作为一种亚细胞成分，在治疗肿瘤方面具有组成明确、活性稳定、安全有效和便于保存等优点。从而显示出良好的应用前景。  

肿瘤exosome诱导的细胞毒性T细胞的特异性杀伤作用

目的:检测癌细胞来源的外排小体exosome在体外刺激细胞毒性T细胞(CTL)特异性杀伤癌细胞的能力。方法:从外周静脉血中分离和培养树突细胞(DC),分离纯化舌鳞癌Tca-8113细胞培养上清液中的exosome,并将exosome负载至DC上,诱导T淋巴细胞活化为细胞毒性T细胞(CTL),把CTL加入到靶细胞(Tca-8113和95-D)培养体系中,18h后利用MTT比色法测定CTL对靶细胞的杀伤活性。结果:从外周静脉血中分离的单核细胞,经粒细胞-单细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的培养可分化为DC,经exosome冲击后,诱导的CTL对Tca-8113细胞具有显著的杀伤作用,在效靶比为20:1时,18h平均杀伤率为(43.60±5.66)%(P<0.01),但对95-D细胞无明显杀伤作用,杀伤率为(29.7±8.78)%(P>0.05)。结论:肿瘤细胞分泌的exosome,负载到DC上后,可以活化T细胞,使之成为抗原特异性的CTL,并具有特异性的杀伤肿瘤细胞的功能。  

离心过滤法提取外切体的实验研究

目的:利用外切体的物理特性,用基于孔径分离的生物膜离心过滤法制备外切体,以降低其研究及应用的技术门槛. 方法:以树突状细胞的培养上清作为外切体的来源,分别用传统的超高速密度梯度离心法和生物膜离心过滤法制备外切体,再利用透射电镜进行两者之间形态学鉴定,聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质成分的鉴定. 结果:两种方法的提取物在超微结构及形态方面非常相像,其蛋白质谱几乎一致. 结论:基于生物膜分离技术的离心过滤法可制备出外切体.  

HepaCAM蛋白通过exosomes途径分泌到细胞外并抑制肿瘤细胞增殖

目的探讨肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)在肾癌786-0细胞中通过exo-somes途径分泌到细胞外及是否可以抑制肿瘤细胞增殖。方法将携带hepaCAM基因的重组腺病毒质粒瞬时转染786-0细胞,Western blot鉴定hepaCAM基因在786-0中的表达;莫能星(monensin)和二甲基阿米洛利(DMA)处理转染后肿瘤细胞,检测肿瘤细胞上清液及exosomes中hepaCAM蛋白的量的变化。MTT法检测hepaCAM蛋白是否可以抑制肿瘤细胞增殖。结果成功构建并转染hepaCAM重组腺病毒质粒,在肿瘤细胞上清液中检测到hepaCAM蛋白的分泌,经药物处理后,莫能星明显增加了转染后肿瘤细胞的hepaCAM蛋白的分泌量,而二甲基阿米洛利处理转染后肿瘤细胞,能显著抑制细胞上清液中hepaCAM的分泌量。Western blot进一步证明hepaCAM蛋白存在于exosomes上。成功转染hepaCAM基因的肾癌细胞分泌的exosomes明显抑制了肿瘤细胞增殖。结论 hepaCAM蛋白可能通过exosomes途径分泌到肿瘤细胞外并抑制肿瘤细胞增殖。  

肾癌ACHN细胞exosome对自身细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨肾癌ACHN细胞来源的exosome对肾癌ACHN细胞自身增殖和凋亡的影响及机制。方法用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法分离纯化肾癌ACHN细胞分泌的exosome;采用CCK-8法评价exosome对肾癌ACHN细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡的变化;RT-PCR和Western blotting检测CyclinD1、caspase-3 mRNA和蛋白的表达;Western blotting检测p-Akt、p-ERK1/2的变化。结果成功使用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法分离纯化肾癌ACHN细胞分泌的exosome。exosome可促进肾癌ACHN细胞增殖,抑制其凋亡;在此过程中,CyclinD1 mRNA和蛋白的表达均上调,而caspase-3 mRNA表达无明显变化,caspase-3蛋白表达下调;同时p-Akt和p-ERK1/2的表达也上调。结论 exosome可促进肾癌ACHN细胞生长和增殖,抑制细胞凋亡。筛除肾癌微环境中的exosome或抑制其功能,可能成为肾癌治疗的有效新方法。  

H22源exosomes瘤苗在小鼠体内的抗肿瘤及免疫调节作用

目的:探讨exosomes瘤苗对小鼠免疫功能及肝癌移植瘤生长的影响.方法:从培养的小鼠肝癌H22细胞上清中分离exosomes瘤苗,以H22细胞接种BALB/e小鼠建市动物模型,随机分为exosomes瘤苗接种组及PBS对照组.15 d后处死小鼠,测量移植瘤体重量,计算抑瘤率;分别称取脾重、胸腺重,检测荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数;用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况和细胞毒活性;酶连免疫吸附试验(Enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)检测脾淋巴细胞产生IL-2、INF-γ的能力.结果:接种exosomes瘤苗能显著抑制肿瘤生长,抑瘤率达42.26%;与对照组比较,实验组荷瘤鼠胸腺指数、脾指数显著提高(P<0.05);exosomes促进脾淋巴细胞增殖并增强其细胞毒活性,同时脾淋巴细胞培养上清中IL-2、INF-γ的水平升高.结论:exosomes瘤苗可能通过增强小鼠的免疫功能抑制小鼠肝癌移植瘤生长.  

三氧化二砷诱导小鼠肝癌细胞H22外泌exosome及相关机制研究

目的 探讨三氧化二砷在小鼠肝癌细胞H22外泌exosome中的影响. 方法 MTT法筛选二氧化二砷的合适药物浓度;密度梯度离心和超速离心法提纯exosome,Bradford法对exosome总蛋白进行定量分析;Western blot检测影响小囊泡vesicle分泌的复合体SNARE的重要组成及凋节蛋白Syntaxin的表达;结合钙荧光探针Fura-2、荧光倒置定量显微镜测定细胞内游离钙的相对浓度.结果维持小鼠肝癌细胞H<22>90%存活48 h的药物浓度为1.25 μmmol/L;药物作用前后,细胞数为5×104ml-1的H22细胞常规培养48 h所得细胞悬液200 ml,经密度梯度离心和超速离心所得exosome的总蛋白浓度分别为(0.85±0.13)、(0.96±0.10)mg/ml,差异具有统计学意义(P<0.05);三氧化:砷作用前后,H22细胞均有Syntaxin蛋白表达,三氧化二砷处理后,其表达明显增加(P<0.05). 结论 SNARE复合体假说也适用于小鼠肝癌细胞H22的exosome外泌过程,三氧化二砷在exosome的外泌过程中有一定的促进作用.