FDA对开发尼古丁替代疗法药品的要求

美国食品药品管理局（FDA）于2019年2月发布了"供企业用戒烟及相关适应症：开发尼古丁替代疗法药品的指导原则"（草案）。该指导原则介绍了FDA对尼古丁替代疗法（NRT）药品总体开发方案的建议，而我国目前尚无类似指导原则。介绍该指导原则的主要内容，期待对我国这类药的研发有益。     

α7烟碱型乙酰胆碱受体调控胆管癌细胞增殖及侵袭的研究

目的探讨在胆管癌细胞增殖和侵袭进程中α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-n ACh R)的调控作用。方法采用尼古丁及α-银环蛇毒素(α-BTX)处理胆管癌QBC939细胞,分为尼古丁组、α-BTX组、尼古丁+α-BTX联合组、空白对照组,采用MTT法观察α7-n ACh R在胆管癌QBC939细胞增殖中产生的影响,采用Transwell小室法观察α7-n ACh R对胆管癌QBC939细胞侵袭力的调节作用。结果在48小时和72小时时胆管癌QBC939细胞增殖能力随尼古丁浓度的升高而增强(48小时:F=80.86,P<0.05;72小时:F=61.49,P<0.05),并且其对胆管癌QBC939细胞增殖的促进作用具有一定的时间依赖性,即在24小时时,不同浓度的尼古丁对胆管癌QBC939细胞增殖的影响无显著差异(P>0.05),但在48小时和72小时时其对胆管癌QBC939细胞增殖的促进作用比较明显。同时Transwell侵袭实验显示,经单纯尼古丁刺激后胆管癌QBC939细胞穿透上室内基质胶到达下室的数量明显增多,尼古丁组和其余各组之间比较存在显著差异(P<0.05)。α-BTX能够明显阻断尼古丁对胆管癌QBC939细胞增殖和侵袭的促进效应。结论尼古丁在胆管癌细胞增殖和侵袭进程中具有显著的增强效应,且可能通过α7-n ACh R发挥这一效应。     

不同浓度尼古丁对种植体骨愈合的影响

目的：探讨不同浓度的尼古丁干预,对种植体周围骨组织的愈合情况和骨保护素（OPG）及骨形成蛋白2（BMP-2）表达情况的影响。方法：选取24只3月龄SD大鼠,雌雄不限,随机数表法分为实验组和对照组,尔后分别采用不同浓度（2mg/kg、0.2mg/kg、0.02mg/kg）的尼古丁和等量生理盐水干预,每天2次背部皮下注射。2周后,大鼠左右胫骨近骺端均植入表面喷砂蚀刻处理的钛合金种植体,并继续施加干预因素。种植后第2、4周分别行X线、 CT、电镜观察和qRT-PCR检测。采用SPSS17.0软件对数据进行单因素方差分析（One-Way ANO-VA test）,组内比较行t检验。结果： X线灰度值显示,除高浓度尼古丁组（HDN）与对照组存在差异（P＜0.05）外,各组组间差异不明显。 CT-BMD值观察,在高浓度或长期尼古丁刺激下种植体周围骨组织矿化程度明显低于对照组,且实验各组差异明显（P＜0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,2周时随着尼古丁干预浓度的增加,种植体周围基因表达量逐渐降低,且与对照组差异明显（P＜0.05）,仅低尼古丁浓度（LDN）组与对照组中的BMP-2的表达无明显差异（1/0.93＆#177;0.17, P＞0.05）;实验第4周,各尼古丁组的基因表达量均出现下调（P＜0.05）。扫描电镜（SEM）观察发现,随着尼古丁浓度和干预时间的增加,骨小梁结构发生改建障碍,多呈纤维骨或编织骨,骨基质分布不均匀且纤维结构排列紊乱无定向。结论：尼古丁对种植体周围骨愈合的抑制作用可能与其下调相关骨活性基因的表达关系密切,且抑制作用受尼古丁干预时间和浓度的影响明显。     

尼古丁对大鼠阴茎勃起功能及阴茎海绵体内源性一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)含量的影响

目的探讨尼古丁对成年雄性大鼠阴茎勃起功能及阴茎海绵体内源性NO及CO含量的影响.方法将40只成年雄性大鼠随机分为4组,对照组、尼古丁皮下注射1、2、3月组.给药方式采用皮下注射.处理后,阿朴吗啡试验观察大鼠阴茎勃起情况.取阴茎海绵体,用硝酸还原酶法检测其NO含量,用改良双波长分光光度法检测其CO含量.结果与对照组比较,尼古丁各组阴茎勃起次数、NO及CO含量明显减少(P <0.01).阴茎勃起次数除尼古丁皮下注射2月组与尼古丁注射1月组之间比较差异无统计学意义(P=0.216)外,其余各组两两比较差异均具有统计学意义(P<0.01).阴茎海绵体NO及CO含量,尼古丁注射各组间两两比较差异均具有统计学意义(P<0.01).阴茎勃起次数、阴茎海绵体中NO及内源性CO含量与尼古丁给药时间呈负相关(r分别为:-0.780、-0.956、-0.914,P=0.000).各组大鼠阴茎海绵体NO与内源性CO含量呈正相关(r=0.876,P=0.000).结论尼古丁可导致成年雄性大鼠阴茎勃起功能减弱,阴茎海绵体中N0及内源性CO含量下降;其影响呈给药时间依赖性;表明内源性CO是尼古丁致阴茎勃起障碍的重要信使分子,尼古丁可能通过降低NO及内源性CO含量致ED.     

AKT 信号转导途径在尼古丁促进大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的：探讨AKT信号途径在尼古丁诱导大鼠气道平滑肌细胞增殖中发挥的作用。方法（1） Western blot检测不同浓度尼古丁作用原代培养的大鼠气道平滑肌细胞不同时间段,AKT／磷酸化AKT、GSK3β／磷酸化GSK3β在气道平滑肌细胞上的表达水平;（2）细胞分析计数仪检测AKT抑制剂和GSK3β抑制剂对尼古丁促进大鼠气道平滑肌细胞增殖活性的影响。实验分组：对照组、尼古丁单独作用组、AKT抑制剂LY294002组、AKT抑制剂LY294002＋尼古丁组、GSK3β抑制剂SB216763组、GSK3β抑制剂SB216763＋尼古丁组;（3） EDU摻入法测定AKT抑制剂和GSK3β抑制剂对尼古丁处理大鼠气道平滑肌细胞DNA复制活性的影响,实验分组同上。对照组应用1％胎牛血清培养基,各抑制剂和尼古丁应用1％胎牛血清培养基配制,分别在尼古丁加入前30 min应用。结果（1）大鼠气道平滑肌细胞上有AKT和GSK3β的表达;尼古丁引起AKT和GSK3β的快速磷酸化,且尼古丁促进AKT和GSK3β的磷酸化作用具有时间依赖性;（2）细胞计数法显示,AKT抑制剂与尼古丁联合组细胞计数明显低于尼古丁单独作用组,差异有统计学意义（P＜0．05）;（3）EDU摻入法测定显示,AKT抑制剂与尼古丁联合组细胞DNA复制水平明显下降,与尼古丁单独作用组相比,差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论尼古丁促进大鼠气道平滑肌细胞的增殖作用依赖AKT／GSK3β信号途径。     

控烟戒烟——关系人民健康的大事

“吸烟有害健康”是公认的事实。然而时至今日，中国的烟民数量不是在下降而是在上升。据卫生部公布的《2007年中国控制吸烟报告》显示：中国是世界上最大的烟草生产国和消耗国，截止到2006年底，我国吸烟者达3．5亿人，被动吸烟5．4亿人，每年约有100万人死于与吸烟相关疾病，预计到2020年我国将有200万人死于吸烟相关疾病。     

尼古丁对Aβ25-35诱导的细胞毒性拮抗作用

目的:研究尼古丁对神经细胞的保护作用及其机制。方法:通过检测细胞形态变化、细胞活力及细胞周期的变化,研究不同浓度尼古丁对PC12细胞的影响。结果:人β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)对PC12的细胞毒性作用呈时间、剂量依赖。尼古丁浓度为1μmol/L至100μmol/L时具有细胞保护作用,但不能逆转Aβ25-35对于细胞的损伤,而高浓度尼古丁(1 000μmol/L)则失去细胞保护作用。结论:Aβ25-35诱导细胞活性下降具有时间、剂量依赖性,此作用可被适宜浓度的尼古丁部分拮抗。     

尼古丁对人RPE细胞及HUVEC的影响

目的探讨尼古丁对人视网膜色素上皮(RPE)细胞和血管内皮细胞(HUVECs)中血管内皮生长因子(VEGF)表达及形成新生血管能力的影响。方法 MTT法检测尼古丁对两种细胞增殖的影响;划痕及成管实验检测其对HUVECs迁移、成管的影响;RT-PCR和Western blotting法检测两种细胞经尼古丁处理后VEGF、PEDF mRNA及蛋白的表达。结果尼古丁促进HUVECs增殖、迁移、成管(P<0.05),但对ARPE-19细胞增殖无影响(P>0.05),且高浓度(100μmol/L)时抑制细胞增殖(P<0.01)。尼古丁以剂量和时间依赖方式促进两种细胞VEGF mRNA及蛋白的表达,抑制PEDF mRNA及蛋白的表达,上调VEGF/PEDF基因表达的比率(P<0.05)。结论尼古丁可上调ARPE-19细胞和HUVECs中VEGF/PEDF基因表达的比率,促进HUVECs增殖、迁移、成管。     

尼古丁对大鼠髌腱肌腱干细胞生物学特性影响的实验研究

目的:探讨体外尼古丁对大鼠髌腱肌腱干细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)的细胞活力、细胞早期凋亡以及肌腱相关基因表达的影响,揭示吸烟导致肌腱病变以及损伤肌腱延迟愈合的潜在细胞学发病机制。方法:无菌条件下取8周龄SD大鼠的髌腱,I型胶原酶消化分离获得单个有核细胞,以最适密度(50个/cm2)进行接种,细胞呈克隆样生长,获得原代TDSCs。基础培养细胞至第3代,将其分为两组,实验组用不同浓度的尼古丁培养基(10-7 M,10-6 M,10-5 M,10-4 M和10-2 M)干预,对照组继续采用基础培养基(0M)培养。处理6 h、24 h、48 h和72 h后分别应用四唑盐(MTT)比色法检测尼古丁对TDSCs体外存活的影响,72h后应用Annexin V-FITC/PI双染法检测尼古丁对TDSCs体外早期凋亡的影响,实时荧光定量PCR(Realtime PCR)检测肌腱相关基因Col1a1和Scx的表达。结果:与对照组相比,实验组不同浓度的尼古丁干预下,TDSCs的细胞活力呈下降趋势,呈时间依赖性和浓度依赖性,浓度高于10-4 M时作用显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测TDSCs早期凋亡(Annexin V+/PI-)的数量随着尼古丁浓度的增加而增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,Realtime PCR检测结果显示:与对照组相比,实验组中Col1a1和Scx的m RNA表达水平均降低,浓度高于10-5 M时作用显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:体外尼古丁可抑制大鼠髌腱TDSCs的细胞活力,导致TDSCs早期凋亡,同时抑制TDSCs中成肌腱分化转录、细胞外基质合成相关基因的表达。这可能是吸烟导致肌腱病变以及损伤肌腱延迟愈合的潜在细胞学发病机制。