苦参碱对TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞成纤维细胞生长因子2的调控作用

目的 研究苦参碱对成纤维细胞生长因子2(FGF-2)在人腹膜间皮细胞(HPMCs)上皮间充质转分化(EMT)中的调控作用。方法 将HPMCs分为三组(对照组、TGF-β1刺激组及0.8 mg/mL苦参碱+TGF-β1处理组);TGF-β1刺激组用含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基,处理组用含0.8 mg/mL苦参碱和5 ng/mL TGF-β1的完全培养基,对照组用等量完全培养基。干预处理48 h后,采用转录组测序分析各组HPMCs细胞FGF-2的mRNA表达情况,最后采用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR分别检测各组HPMCs细胞FGF-2蛋白和mRNA的表达情况。结果5 ng/mL TGF-β1刺激HPMCs细胞,发现其能上调FGF-2的蛋白和mRNA的表达水平(其中蛋白上调2.00倍,mRNA上调6.18倍),而苦参碱干预后能显著下调TGF-β1刺激后FGF-2的蛋白和mRNA的表达水平(其中蛋白下调1.77倍,mRNA下调4.30倍)。结论 苦参碱通过对成纤维细胞生长因子2发挥抑制作用,进而阻止成纤维细胞在腹膜聚集,最终防止腹膜纤维化的发生。     

糖肾平通过TGF-β1-Smad2/3-ILK信号通路干预高糖＋LPS诱导足细胞上皮间质转分化的分子机制研究

也页目的：探讨糖肾平对高糖环境下脂多糖（ lipopolysaccharide,LPS）刺激足细胞上皮间质转分化的影响,并探讨其作用机制。方法：以体外培养大鼠肾小球足细胞为研究对象,以高糖（25 mmol/L）、LPS（1μg/mL）刺激足细胞建立模型,分为正常组、高糖组、高糖＋LPS组、厄贝沙坦组、抑制剂组、糖肾平小、中、大剂量组。采用Western blotting及RT-PCR方法检测足细胞中转化生长因子-β1（ transforming growth factor-β1,TGF-β1）、Smad2/3、整合素连接激酶（ integrin-linked kinase, ILK）、CD2相关蛋白（CD2AP）、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）的表达水平。结果：与正常组比较,高糖组和高糖＋LPS组足细胞TGF-β1、ILK、α-SMA蛋白及其mRNA表达明显增加（P〈0.01）,P-Smad2/3蛋白及Smad2/3 mRNA表达明显增加（P〈0.01）,CD2AP蛋白及其mRNA表达明显减少（P〈0.01）;与高糖＋LPS组比较,厄贝沙坦组足细胞P-Smad2/3、α-SMA蛋白表达明显减少（P〈0.01）,TGF-β1蛋白表达减少（P〈0.05）,TGF-β1,Smad2/3,α-SMAmRNA表达明显减少（P〈0.01）,ILK mRNA表达减少（P〈0.05）,CD2AP蛋白及其mRNA表达明显增加（P〈0.01）;糖肾平大、中、小各剂量组足细胞TGF-β1蛋白表达明显减少（P〈0.01）,糖肾平大剂量组足细胞TGF-β1 mRNA表达减少（P〈0.05）,小、中剂量组表达明显减少（P〈0.01）;糖肾平小、中、大各剂量组足细胞P-Smad2/3蛋白及Smad2/3mRNA表达均明显减少（P〈0.01）;糖肾平小、大剂量组足细胞ILK mRNA表达减少（P〈0.05）,中剂量组表达明显减少（P〈0.01）;糖肾平大剂量组足细胞α-SMA蛋白及其mRNA表达减少（P〈0.05）;糖肾平小、中、大各剂量组足细胞CD2AP蛋白及其mRNA表达均明显增加（P〈0.01）。结论：糖肾平能够降低足细胞TGF-β1、ILK蛋白及mRNA表达,降低P-Smad2/3蛋白及Smad2/3 mRNA表达,升高足细胞标志物CD2AP蛋白及mRNA表达,降低间充质细胞标志物α-SMA蛋白及mRNA表达,通过抑制TGF-β1-Smad2/3-ILK信号通路的激活减少足细胞转分化,保护足细胞,可能是其防治糖尿病肾病的作用机制之一。     

胰岛干细胞转分化胰岛样细胞与天然胰岛功能的比较

目的:目前在胰腺干细胞体外转分化为胰岛样细胞的转化效率,转分化胰岛样细胞的成熟度,能否代替天然胰岛的功能等问题上存在争议.实验将分离纯化、扩增的大鼠胰腺导管上皮细胞,并诱导分化为胰岛样细胞团,与天然胰岛功能进行比较.方法:实验于2004 07/2005-04在暨南大学第二临床医学院暨深圳市人民医院临床医学研究中心实验室完成.实验选用SD大鼠10只,采用差异性贴学、低血清培养等方法纯化大鼠胰腺导管上皮细胞,以免疫组织化学方法鉴定后,在含exendin-4、角质细胞生长因子、尼克酰胺等细胞因子和葡萄糖的培养基中,将其转分化为胰岛样细胞团.以DTZ染色和胰岛素免疫荧光染色鉴定.分离纯化SD大鼠天然胰岛,对胰岛样细胞团与天然胰岛进行葡萄糖刺激试验,检测培养液上清液中胰岛素和C肽的水平.结果:①免疫组织化学染色显示从大鼠胰腺导管上皮细胞分离纯化的细胞呈CK-19染色阳性,PDX-1染色阴性,表明为胰腺干细胞.诱导4周后,细胞逐渐汇聚成胰岛样细胞团,免疫荧光染色为阳性,证明有胰岛索分泌.②葡萄糖刺激实验显示,在低糖和高糖刺激下,胰岛样细胞团胰岛素的分泌量约为天然胰岛的1/30和1/35,C肽分泌量为天然胰岛的1/32和1/26.结论:目前胰腺干细胞体外转分化为胰岛样细胞的成熟度与天然胰岛仍然存在较大差别,其在功能仅为天然胰岛的1/30～1/35.     

黄芪注射液对肺纤维化小鼠肺组织上皮-间质转分化的影响

目的观察黄芪注射液对肺纤维化小鼠肺组织上皮-间质转分化(EMT)的影响,研究其对肺泡上皮细胞EMT过程的干预作用及可能机制。方法将30只实验小鼠随机平均为纤维化组、黄芪组、PBS对照组。纤维化组小鼠气管内灌注博莱霉素3 mg/kg;PBS对照组小鼠于气管灌注等量PBS;黄芪组小鼠给予气管灌注博莱霉素3 mg/kg,并且于实验造模后10 d腹腔注射黄芪注射液5 m L/kg,连续给药2周。实验第24天处死小鼠,肺组织切片行Masson染色观察肺组织病理改变,碱裂解法检测肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量,ELISA法检测小鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)水平,Western blot法检测肺组织中上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达量。结果与纤维化组比较,黄芪组小鼠肺组织肺纤维化病理损伤明显减轻,胶原沉积减少;黄芪组小鼠肺组织中HYP含量和α-SMA蛋白表达量均明显低于纤维化组(P均<0.05),E-cadherin蛋白表达量明显高于纤维化组(P<0.05);黄芪组血清TNF-α和TGF-β1水平均明显低于纤维化组(P均<0.05)。结论黄芪注射液能下调TNF-α和TGF-β1表达,抑制肺泡上皮细胞EMT现象,从而改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化病理改变。     

糖肾宁对糖尿病肾病KKAy 小鼠的肾脏保护作用及其对Notch/Snail1 信号转导通路的影响

目的：明确糖肾宁是否通过干预Notch/snail1通路抑制KKAy小鼠糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化肾间质纤维化。方法：KKAy小鼠30只,经过10周专用鼠料饲养,血糖>16.7 mmol?L-1,24 h尿蛋白>0.4 mg为糖尿病肾病动物模型。造模成功小鼠按血糖和体质量分层随机分为模型组、厄贝沙坦组与糖肾宁组,灌胃给药,雌性C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组。检测小鼠一般状况,称体重、测24 h尿蛋白定量。干预16周后取材,检测血糖、尿素氮（Blood Urea Nitrogen,BUN）、血清肌酐（Serum creatinine,Scr）;肾组织行HE、Mallory染色。原位杂交及Western blotting 法检测小鼠肾组织中Notch/snail1通路、α-SMA、E-Cadherin蛋白及mRNA表达。SPSS20.0软件进行统计学处理。结果：与模型组比较,糖肾宁组小鼠一般状态改善,体质量、24 h尿蛋白定量显著减少（P<0.01）,血清BUN及Scr含量降低（P<0.01,P<0.05）,病理染色显示肾间质纤维化明显减轻,糖肾宁组肾组织Notch/snail1通路和α-SMA蛋白及mRNA表达明显降低,有显著统计学差异（P<0.01）,E-Cad蛋白及mRNA表达显著升高（P<0.01）。结论：糖肾宁可以保护糖尿病肾病肾功能,延缓糖尿病肾病进展,抑制糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化肾间质纤维化,改善糖尿病肾病EMT的机制可能是通过抑制Notch/snail1通路表达实现。     

糖肾平对糖尿病肾病KKAy小鼠肾脏保护作用及对RhoA/ROCK信号通路影响的研究

目的：探讨糖肾平对糖尿病肾病（DiabeticKidneyDisease,DKD）KKAy小鼠肾保护作用及其对RhoA/ROCK信号通路的影响。方法：雌性10周龄SPF级KKAy小鼠60只,KK鼠料诱导10周建立DKD模型,随机分为模型组、厄贝沙坦组、糖肾平低（0.525g?kg-1）、中（1.05g?kg-1）、高（2.1g?kg-1）剂量组,10只雌性C57BL/6J小鼠为正常组。各治疗组灌胃给药,正常组、模型组灌胃等体积去离子水,每4周称体质量并测24h尿蛋白定量。第26周小鼠麻醉后摘眼球取血,称肾质量、测空腹血糖（FastingBloodGlucose,FBG）、血尿素氮（BloodUreaNitrogen,BUN）、血肌酐（Serumcreatinine,Scr）和甘油三酯（Triglyceride,TG）含量;HE、Mallory和PAS染色观察肾组织病理;免疫组化、原位杂交测肾组织转化生长因子-β1（Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)、Ras同源基因家族成员A（RashomologgenefamilymemberA,RhoA）、Rho相关卷曲蛋白激酶（Rho-associatedcoiledcoil-containingproteinkinase1,ROCK1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SmoothMuscleActin,α-SMA）、E-钙黏素（ECadherin,E-Cad）mRNA及蛋白表达。结果：与模型组相比,各治疗组体质量、肾质量/体质量、尿蛋白降低,糖肾平中、高剂量组有显著性差异（P＜0.01）;肾病理损害明显减轻,FBG、BUN、Scr、TG含量降低（P＜0.01）,ECadherinmRNA及蛋白表达增加,TGF-β1、RhoA、ROCK1和α-SMAmRNA和蛋白表达减少,糖肾平中、高剂量组差异显著（P＜0.01）。结论：糖肾平对DKDKKAy小鼠肾的保护作用及抑制肾小管上皮细胞转分化的作用,可能与调节RhoA/ROCK信号通路有关。     

基于CXCL12/CXCR4生物轴探讨清心饮抑制CVB3感染后CMVECs发生EndMT的作用

[目的] 探讨趋化因子12(chemokine 12,CXCL12)/趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)生物轴在清心饮含药血清抑制柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B3,CVB3)感染后心脏微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMVECs)发生内皮间充质转分化(endothelial-mesenchymal transition,EndMT)过程中的作用。[方法] 取生长状态良好的CMVECs设计为正常对照组、模型组、CXCR4拮抗剂组、清心饮组和清心饮+CXCR4拮抗剂组。除正常对照组用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的杜尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco‘s modification of Eaglews medium,DMEM)培养外,其余各组CMVECs先用CVB3培养基感染2 h,后弃去CVB3培养基,改为普通培养。通过细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK8)检测各组细胞活力,免疫荧光(immunofluorescence,IF)、免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)等实验方法检测内皮细胞标志物血小板-内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31)、间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、CXCL12和CXCR4的蛋白及基因表达。[结果] 与正常对照组比较,模型组CD31表达下降(P＜0.01),α-SMA、CXCL12和CXCR4表达增强(P＜0.01)。与模型组比较,CXCR4拮抗剂组、清心饮组CD31表达增强(P＜0.01),α-SMA和CXCR4表达下降(P＜0.01),CXCR4拮抗剂组CXCL12表达差异无统计学意义(P＞0.05),清心饮组CXCL12表达下降(P＜0.05)。与清心饮组比较,清心饮+CXCR4拮抗剂组CD31的表达增强(P＜0.05),α-SMA、CXCL12和CXCR4表达下降(P＜0.01,P＜0.05)。[结论] CXCL12/CXCR4生物轴参与了CVB3感染后CMVECs发生EndMT的过程,拮抗CXCL12/CXCR4生物轴能够明显增强清心饮对该过程的抑制。     

二十碳五烯酸对白蛋白诱导肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)对人白蛋白诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)发生转分化的干预作用.方法 体外培养人HK-2细胞,随机分为6组:A组,空白对照组(未加任何刺激物);B组,单纯EPA组(加入30 μmol/L EPA);C组,血白蛋白(albumin,Alb)诱导组(加入5 mg/ml Alb);D组,低剂量EPA干预组(5mg/ml Alb+ 10 μmol/L EPA);E组,中剂量EPA干预组(5mg/ml Alb+ 30 μmol/L EPA);F组,高剂量EPA干预组(5 mg/ml Alb+ 50μmol/L EPA).细胞免疫荧光检测E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle ac-tin,α-SMA)的表达;ELISA法检测纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的水平;采用RT-PCR检测转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的mRNA表达.结果 与A组比较,B组TGF-β1mRNA、α-SMA、FN、E-cadherin表达均无统计学差异(P＞0.05);C组TGF-β1 mRNA、α-SMA、FN较其他各组表达明显增高(P＜0.05),而E-cadherin表达明显下降(P＜0.05).与C组比较,D组、E组、F组TGF-β1 mRNA、α-SMA、FN表达逐渐下降,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);E-cadherin的表达逐渐增高,各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).提示EPA可显著抑制Alb刺激人肾小管上皮细胞表达E-cadherin、α-SMA,同时下调上清液中FN水平,且其抑制作用的强弱与EPA浓度密切相关.EPA还明显下调了Alb刺激后TGF-β1的表达.结论 一定浓度的人白蛋白可以诱导体外培养的HK-2细胞发生转分化;EPA可一定程度上抑制白蛋白诱导HK-2发生转分化过程,且呈剂量依赖性.     

阻断Rac1对转化生长因子-β诱导视网膜色素上皮细胞行为改变的作用研究

目的 观察转化生长因子β1(TGF-β1)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞间质样转分化(EMT)过程中Rac1在其细胞学行为改变中的作用.方法 人RPE-19细胞分为空白组、TGF-β1组、TGF-β1+NSC23766组、NSC23766组.所有实验于加入TGF-β1前2h给予NSC23766以封闭Rac1受体.免疫荧光、蛋白免疫印迹法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;细胞划痕、侵袭及凝胶收缩实验,观察NSC23766对细胞迁徙、侵袭、凝胶收缩作用.结果 TGF-β1组细胞中α-SMA荧光表达较空白组、TGF-β1+ NSC23766增强,差异有统计学意义(F=825.314,P=0.003);细胞划痕实验结果显示,TGF-β1组细胞间距小于TGF-β1+ NSC23766组,差异有统计学意义(P24h=0.04,P48h =0.001);与空白组细胞间距比较,差异无统计学差异(P=0.278).细胞侵袭实验结果显示,TGF-β1组穿过纤维膜的细胞数与空白组、TGF-β1+ NSC23766组、NSC23766组穿过纤维膜的细胞数比较,差异无统计学意义(F=0.371,P=0.055).凝胶收缩实验结果显示,TGF-β1组能明显增加细胞的促凝胶收缩能力,组间差异有统计学意义(F=40.473,P=0.014),TGF-β1组相对TGF-β1+ NSC23766组,差异有统计学意义(P=0.022).结论 Rac1在TGF-β1诱导RPE细胞凝胶收缩改变中发挥作用;NSC23766可通过调控Rac1活化抑制RPE细胞学行为的改变.     

镰形棘豆总黄酮对糖尿病KKay小鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 观察镰形棘豆总黄酮对糖尿病KKay小鼠肾小管上皮细胞转分化的影响。方法 选择糖尿病KKay小鼠模型，分别以低、中、高剂量(0.1、0.2、0.4 g/kg)的镰形棘豆总黄酮每日灌胃1次，连续4周。每天给药前观察动物一般状况；造模的第0、2、4周分别检测记录一般状况、体质量和空腹血糖；第5周时，取肾脏组织进行HE染色，采集的血清中肌酐(creatinine, Cr)、尿素氮(urea nitrogen, BUN)、尿酸(uric acid, UA)含量变化用于评价肾功能以及检测肾间质中的基因、蛋白表达。结果 与模型组比较，镰形棘豆总黄酮可以剂量相关性地减轻糖尿病KKay小鼠的体质量、血糖显著下降(P<0.05);24 h尿微量白蛋白(UAlb)显著下降，血清中Cr、BUN以及UA均显著降低(P<0.05);肾脏组织形态学观察肾组织中肾小球数量明显增多，肾小球细胞数目以及肾小球系膜区细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)明显减少；抗体E-钙黏连蛋白(E-cadherin)的表达水平有所提高，而α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达显著下降(P<...