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1.
背景:脑损伤是中枢神经系统的一种严重创伤,如何促进脑损伤后的神经再生和功能恢复尤为棘手。嗅鞘细胞有利于神经元存活,并促进轴突再生。 目的:进一步探讨嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑损伤的可行性及效果。 方法:健康成年SD雄性大鼠90只,取10只用于制备嗅鞘细胞,剩余80只随机均分为2组,采用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,1周后细胞移植组经颈动脉将2×106个嗅鞘细胞注入脑缺血大鼠体内,模型对照组同法注入等体积无菌生理盐水。采用爬行记分法检测神经功能缺损情况,苏木精-伊红染色检测损伤脑组织病理变化,免疫组化染色法测定损伤脑组织中胶质原纤维酸性蛋白和神经营养因子受体p75的表达。 结果与结论:与模型对照组比较,脑缺血再灌注后1,2,3,4周细胞移植组神经功能缺损评分均明显降低(P < 0.05);损伤脑组织病理变化减轻,神经细胞变性及坏死数量明显变少,间质水肿较轻。细胞移植组在梗死半球可见大量胶质原纤维酸性蛋白和神经营养因子受体p75阳性细胞,对侧半球及血管内皮细胞处也可见少量分布;模型对照组呈阴性表达。结果进一步验证了嗅鞘细胞移植治疗大鼠缺血性脑损伤是可行有效的。  相似文献
2.
背景:目前国内外对嗅鞘细胞培养条件的报道各不相同,个别方法重复性较差,不利于实际应用。 目的:观察差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞的效果,并与化学药物法、差速贴壁法培养结果进行比较。 设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-06在福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系实验室完成。 材料:新生2 d的SD大鼠8只,由福建医科大学试验动物中心提供。 方法:无菌条件下完整取出大鼠双侧嗅球,剥除嗅球表面的软脑膜及毛细血管网,剪成0.5 mm3的小块进行胰蛋白酶消化,过筛后按4.0×108 L-1密度种植于包被多聚左旋赖氨酸的培养瓶中进行原代培养。设立4组:①未经纯化的常规对照组。②化学药物组加入5 μmol/L阿糖胞苷抑制成纤维细胞分裂。③差速贴壁组采用Nash差速贴壁法纯化嗅鞘细胞。④差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组首先采用Nash差速贴壁法去除大部分成纤维细胞,而后对于少量残留的成纤维细胞加入阿糖胞苷处理,培养6 d贴壁细胞大部分融合后,加入1.25 g/L胰蛋白酶消化1 min,显微镜下见突起回缩、细胞变圆、少量细胞浮起时终止消化。 主要观察指标:嗅鞘细胞的形态,NGFR p75免疫细胞荧光染色结果。 结果:体外培养的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长;未经纯化的常规对照组培养7 d时视野内成纤维细胞已达60%以上,至14 d成纤维细胞完全长满;经过纯化处理的另外3组始终以嗅鞘细胞居多,嗅鞘细胞的形态与原代基本相同。存活的双极和3极嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性反应,但化学药物组、差速贴壁组嗅鞘细胞纯度偏低,仅为75%;差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组嗅鞘细胞纯化效率明显增高,达85%以上。 结论:实验结果证实了差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法的三合一操作技术,是一种高效率的纯化培养嗅球嗅鞘细胞的方法。  相似文献
3.
目的 探索嗅鞘细胞脑出血大鼠脑内移植后运动神经功能及形态学改变.方法 差速贴壁法培养出较高纯度的嗅鞘细胞,用PI和P75荧光双染鉴定细胞,制作30只脑出血大鼠模型,分A、B、C 3组.A组10只为单纯脑出血组;B组10只为培养液移植组;C组10只为嗅鞘细胞移植组.3组大鼠分别在术前1h,术后7d、14d、21d、28d进行运动功能学评分,并于细胞移植后第4周、第8周取脑组织做冰冻切片,通过免疫荧光检测移植细胞在大鼠脑内形态学改变.结果 试验中分离、培养的嗅鞘细胞经标记移植入大鼠脑内后,经免疫荧光检测证实能在血肿腔边缘分化为成熟神经元细胞和星形胶质细胞.对3组大鼠术后进行评分,细胞移植组从第21天起其功能恢复明显优于其它两组(P<0.001).结论 嗅鞘细胞在脑出血大鼠脑内能存活并分化为成熟神经元及星形胶质细胞,能促进运动神经功能恢复.
Abstract:
Objective The olfactory ensheathing cells ( OECs) transplanted into cerebral hemorrhage mode to alter motor nerve function and the study of morphology. Methods Get high purification of olfactory ensheathing cells by using the method of the differing rates of attachment of the various cells type, use the technology of fluoresceinstain identificated the OECs by both PI and P75 ,make 30 rats of cerebral hemorrhage mode,and separate 3 groups. Ten rats in the A group are the blank group;Ten rats in the B group are the DPBS transplanting group;Ten rats in the C group are the OECs transplanting group. The three groups are all scored in 1 hour before operation and 7 days, 14 days,21 days and 28 days after operation by Rosenberg GA method. Evaluate the contribution of OECs transplanting curing rat cerebral hemorrhage by statistics method. And get brain of rat to make frozen section in 4weeks,8weeks after operation. Detection the morphology of transplanting cells by immunofluorescence technique. Results We get in experiment transplantd in cerebral hemorrhage rats brain. We found these OECs differentiating to riped neuron cell and horizontal cell unround cavity of blood tumor by immunofluorescence way. After scoring the three groups by Rosenberg GA method and statisticing them. We found that olfactory ensheathing cells injected significantly reduced motor deficits compared with control groups which cerebral hemorrhage after 21 days (P <0.001). Conclusions The OECs survival in the brain of rat cerebral hemorrhage, then differentiating to ripe neuron cell and horizontal cell. The treatment of OECs transplanting for rat cerebral hemorrhage could promote recovery of motor nerve function.  相似文献
4.
目的 探讨移植用成年大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的培养和纯化方法.方法 取成年SD大鼠嗅球,将分离消化所得细胞悬液进行接种.然后分别于接种后2 h、6 h和18 h 3个时间点进行单步骤差速贴壁法去除成纤维细胞,纯化嗅鞘细胞,纯化培养约11 d时采用神经生长因子受体P75(NGFRP75)和碘化丙啶(PI)双染OECs并对其纯度及细胞数量进行免疫荧光鉴定分析.结果 纯化培养11 d后在共聚焦显微镜下呈双染阳性的细胞为OECs,数量级达106/mL,形态以梭形、双极或三极突起为主,亦有少量多极或单极细胞.2 h、6 h和18 h组嗅鞘细胞纯度分别为(53±5)%、(73±8)%和(69±13)%,组间差异有统计学意义(F=11.766,P<0.001). 结论分别经2、6、18 h单步骤差速贴壁法纯化的OECs在纯度和数量级上均可满足移植用细胞的要求,且方法简单、经济、快捷.  相似文献
5.
神经干细胞(NSCs)能分化成神经元替代坏死,凋亡神经元,嗅鞘细胞(OECs)是一种特殊类型的胶质细胞,两种细胞联合移植能在中枢神经系统修复过程中起到互补作用,更好地修复损伤组织,改善宿主运动及认知功能。  相似文献
6.
进行中枢神经系统损伤修复的候选胶质细胞包括嗅鞘细胞、少突胶质前体细胞和许旺细胞。少突胶质前体细胞很难获得大量移植用供体细胞,许旺细胞很难穿透胶质瘢痕,从应用方面均不如嗅鞘细胞。离体培养中嗅鞘细胞极强的可塑性可能会使嗅鞘细胞适时改变自身形态,以适应体内复杂的微环境,有利于神经再生。嗅鞘细胞移植后对脊髓后根损伤后再生有一定作用,其作用大小可能与嗅鞘移植物的成分有关,细胞制备技术和混合细胞移植能影响嗅鞘细胞移植物的效果。虽然胎脑的免疫原性很低,但合理应用免疫抑制剂会使嗅鞘细胞的移植效果有所改观。嗅鞘细胞除了重建损伤通路外,还可能通过轴突发芽、在非突触部位释放单胺类物质、改善病变部位环境并帮助附近的残余神经纤维保存功能和活性等机制对中枢神经的功能发生作用。嗅鞘细胞的细胞生物学和移植后行为学的深入研究都会加快人们对脊髓损伤的理解,并对脊髓损伤的修复治疗产生重要的理论指导意义。  相似文献
7.
背景:目前常用的嗅鞘细胞培养方法有差速贴壁法、化学抑制法、抗体亲和吸附法、补体法等,各自均存在优缺点,单一使用某种方法时细胞纯化率较低。 目的:拟采用改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法体外分离纯化大鼠嗅球及嗅黏膜来源的嗅鞘细胞。 设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-11/2008-05在武汉大学人民医院骨科实验室和消化内科实验室完成。 材料:10周龄Sprague-Dauley大鼠10只,由武汉大学人民医院实验动物中心提供,阿糖胞苷由武汉大学人民医院制备。 方法:完整取大鼠双侧嗅球及剪取鼻中隔后1/3嗅黏膜,剪碎后胰酶消化,制成单细胞悬液,按1×109 L-1密度接种于未包被的25 cm2玻璃培养瓶中,18~20 h后将细胞悬液转移至另一未包被的25 cm 2玻璃培养瓶中(第1次差速贴壁),24 h后再将细胞悬液转移至经多聚右旋赖氨酸包被的25 cm2塑料培养瓶或经多聚右旋赖氨酸包被的6孔培养板中(第2次差速贴壁),接种培养48 h后半量换液以去除杂细胞。在差速贴壁培养后二三天,加入3.0~5.0 pmol/L阿糖胞苷去除残余成纤维细胞。 主要观察指标:嗅鞘细胞的形态观察、分裂增殖情况、免疫荧光染色鉴定结果及纯度测定。 结果:体外培养24 h嗅球源性嗅鞘细胞即可贴壁,而嗅黏膜源性嗅鞘细胞多在培养四五天后贴壁,两种来源的嗅鞘细胞形态相似,以双极或梭形细胞为主,少量为3极及多突起形多级细胞,同时夹杂扁平、煎鸡蛋形细胞。纯化培养10 d的嗅鞘细胞,胶质纤维酸性蛋白、神经生长因子受体p75免疫荧光染色及神经生长因子受体p75+hoechs免疫荧光双染后大部分双极或多极细胞膜、胞体、突起呈阳性,细胞纯度可达90%以上。 结论:改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法可在体外成功分离培养出高纯度的嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞,嗅球源性嗅鞘细胞贴壁时间及分裂增殖程度优于嗅黏膜源性嗅鞘细胞。  相似文献
8.
背景:细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,嗅鞘细胞被认为是最适合的种子细胞之一,但目前对其培养纯化的方法尚无公认标准。 目的:运用改良差速贴壁法+含同源嗅鞘上清液的无血清条件培养液来纯化培养嗅鞘细胞,以期建立一种新颖、经济、简单、实用的纯化培养成年大鼠嗅鞘细胞的方法。 设计、时间和地点:观察性对照实验。实验于2008-02/06在苏州大学干细胞与组织工程实验室完成。 材料:健康成年SD大鼠6只,体质量150~180 g。 方法:①无菌条件取大鼠嗅球组织,消化、离心去除上清液后,用含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬,稀释的单细胞混悬液均分成3份,分别用于单纯改良差速贴壁、单纯无血清条件培养液纯化和改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化的实验。②单纯改良差速贴壁:将单细胞混悬液以8 000个/cm²密度种植于无包被的25 cm²培养瓶中。经12 h+ 24 h两次差速培养后,吸出细胞上悬液,计数板计算浓度后,按1×109 L-1浓度重新种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中继续培养3周。③单纯无血清条件培养液纯化:将单细胞混悬液用预先收集并制备的含同源嗅鞘培养上清液的无血清条件培养液直接种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中,孵育两三天后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F12培养基继续培养3周。④改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化:经12 h +24 h两次差速纯化,吸出上悬液接种于培养皿中继续培养2.0~3.0 d后,改换成无血清条件培养液,孵育36~48 h后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F-12培养基继续培养。以后视情况每3~5 d半量换液1次,培养3周。 主要观察指标:运用倒置显微镜观察各组不同时间的嗅鞘细胞生长状况和形态学特征。采用GFAP、NGFRp75和Hoechst33258等抗体,于分离培养14 d后进行细胞免疫荧光染色并检测嗅鞘细胞的纯度。 结果:①倒置显微镜观察:差速后3 d内有大量细胞贴壁生长,细胞形态较混杂,辨认嗅鞘细胞较困难。差速后再运用无血清条件培养液2 d后,可见纯度较高的典型嗅鞘细胞形态,以双极梭形和多极为主,细胞突起细长。伴少量扁平状“油煎蛋样”细胞。继续培养至14 d可见细胞立体感及折光性最佳,数量和纯度最高。培养3周后3组细胞开始老化,活力明显下降,成纤维等杂细胞开始挤占原嗅鞘细胞生长空间。②免疫荧光染色显示嗅鞘细胞特异性表达GFAP和NGFRp75,单纯差速后嗅鞘细胞纯度仅有72%~75%,单纯无血清条件培养液纯化后仅为48%~52%,改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化组纯度可达88%~92%。 结论:实验建立了完善的成年大鼠嗅鞘细胞培养纯化新方法。  相似文献
9.
背景:近年研究证实嗅鞘细胞具有支持和促进多种神经元存活和轴突再生的作用,与其分泌的神经营养活性物质相关,如神经生长因子、脑源性神经营养因子等。神经营养活性物质在维持神经元存活、生长以及损伤后修复与再生方面的作用值得关注。 目的:探讨神经生长因子是否在嗅鞘细胞条件培养液的神经保护中发挥重要作用。 设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2006-01/2007-03在解放军南京军区南京总医院神经内科实验室完成。 材料:成年SD大鼠30只用于嗅鞘细胞培养,出生24 h内的SD乳鼠60只用于脑海马神经元培养。 方法:采用差速贴壁法纯化大鼠嗅鞘细胞,添加Forskolin和碱性成纤维细胞生长因子促进细胞增殖,培养至10 d,取生长状态良好的细胞,按1×109 L-1密度接种,待细胞贴壁后加入含B27的Neurobasal培养基,48 h后收集上清液。待所有嗅鞘细胞条件培养液收集完毕后,将其混合,低温离心后收集浓缩的嗅鞘细胞条件培养液,-80 ℃保存备用。取体外分离培养的乳鼠脑海马神经元,设立正常组、谷氨酸损伤模型组、嗅鞘细胞条件培养液组、抗神经生长因子抗体+嗅鞘细胞条件培养液组。 主要观察指标:海马神经元活性,上清液中乳酸脱氢酶浓度,神经元凋亡率。 结果:与正常组比较,其余3组神经元活性均明显下降(P < 0.05或0.01);与谷氨酸损伤模型组比较,嗅鞘细胞条件培养液组、抗神经生长因子抗体+嗅鞘细胞条件培养液组神经元活性均明显增高(P < 0.01或0.05),且前者升高幅度大于后者(F=5.85,P < 0.05)。与正常组比较,其余3组乳酸脱氢酶浓度及神经元凋亡率均明显增高(P < 0.05或0.01);与谷氨酸损伤模型组比较,嗅鞘细胞条件培养液组、抗神经生长因子抗体+嗅鞘细胞条件培养液组乳酸脱氢酶浓度及神经元凋亡率均明显下降(P < 0.01或0.05),且前者下降幅度大于后者(F =5.04,F =5.16,P < 0.05)。 结论:嗅鞘细胞条件培养液可提高损伤海马神经元活性,抑制上清液中乳酸脱氢酶释放和神经元凋亡;消除神经生长因子后,以上保护作用减弱,提示嗅鞘细胞条件培养液中存在多种营养物质共同发挥神经保护作用,尤以神经生长因子为重。  相似文献
10.
背景:嗅鞘细胞是目前已知用于移植细胞中惟一可以跨越周围神经系统与中枢神经系统边界的细胞。在众多的国内外文献中,大多以嗅球来源嗅鞘细胞作为观察对象;但采用嗅黏膜嗅鞘细胞移植具有来源方便、损伤小、可自体取材等优势。 目的:比较嗅球来源嗅鞘细胞和嗅黏膜嗅鞘细胞移植对脑出血后神经功能损伤恢复作用的差异。 设计、时间及地点:免疫组织化学水平的随机对照动物实验,于2005-10/2007-10在无锡市第三人民医院细胞实验室完成。 材料:选用健康雄性SD大鼠30只,按随机数字表法分为3组,对照组、嗅球来源嗅鞘细胞移植组及嗅黏膜嗅鞘细胞移植组各10只。 方法:分别获取人鼻中隔黏膜、人胚嗅球,进行嗅鞘细胞的分离培养纯化,取培养10 d的细胞用作细胞移植。取SD大鼠制备尾状核出血模型,嗅球来源嗅鞘细胞移植组及嗅黏膜嗅鞘细胞移植组各取10μL细胞悬液在立体定向下引导微量注射器向大鼠脑组织内匀速注射(1 μL/min),对照组注入等量培养基,注射点为右侧尾状核。 主要观察指标:观察两种来源嗅鞘细胞的体外培养情况。嗅鞘细胞移植后对动物行定期行为学评定,功能损伤越重,得分越高;并观察组织切片靶区域免疫细胞化学分析结果。 结果:从体外培养结果看,无论在形态上还是表型上,两者无明显区别。嗅球来源嗅鞘细胞移植组及嗅黏膜嗅鞘细胞移植组大鼠的Longa 5分制法及前肢放置试验评分在移植后第14,28,56天显著低于对照组(P < 0.05),两移植组差异无显著性意义(P > 0.05),移植组各时间段差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论:用于移植修复神经功能的两种嗅鞘细胞在细胞特性、移植效果方面均无明显差异。  相似文献
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