DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的：构建DEK基因的RNA干扰（ RNAi）慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经BamHⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA（ siRNA）表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素（ puromycin,puro）筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应（ real time-PCR,RT-PCR）和Western印迹分别检验DEK在信使RNA （ mRNA ）和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。 RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明, DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。     

DEK蛋白在宫颈癌病因学中的意义研究

目的:检测DEK蛋白在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌组织中的表达情况,探讨其在宫颈癌发病机制中的作用。方法:采用免疫组织化学方法检测DEK蛋白在35例宫颈癌组织,30例宫颈上皮内瘤变(CIN)及20例正常宫颈组织的表达情况,分析DEK蛋白的表达与宫颈癌发生的关系。结果:宫颈癌组织中DEK蛋白表达率(74.3%)高于宫颈上皮内瘤变组织(23.3%)和正常组织(15.0%),差异具有显著性意义(P<0.05),宫颈上皮内瘤变组织和正常组织,二者无统计学意义(P>0.05)。结论:DEK蛋白在宫颈癌中表达升高,可能与宫颈癌的发生有关,DEK蛋白可作为宫颈癌病因学的一个新指标。     

DEK基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖和凋亡影响的研究

目的:通过观察DEK基因沉默后对CaSki细胞增殖、细胞周期及凋亡影响,探讨DEK原癌基因siRNA对宫颈癌细胞的影响和机制.方法:将DEK siRNA真核表达载体转入CaSki细胞,转染48 h后,采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期改变情况.结果:与对照组和未转染组相比,转染psiRNA-hH...     

肝脏特异性DEK基因敲除小鼠模型的制备及鉴定

目的　利用Cre/loxp基因敲除技术构建肝脏特异性DEK基因敲除小鼠,为研究DEK基因在肝脏中的生物学功能提供重要动物模型。 方法　将DEKflox/flox小鼠与肝脏特异性表达Alb-Cre重组酶的小鼠进行交配和鉴定,筛选出子代中DEKflox/+/Alb-Cre小鼠与DEKflox/flox小鼠进行交配与鉴定,获得DEKflox/flox/Alb-Cre小鼠,将DEKflox/flox/Alb-Cre小鼠与DEKflox/flox小鼠进行交配,其子代基因型为DEKflox/flox/Alb-Cre的小鼠即为本实验所构建的肝脏特异性DEK基因敲除小鼠,DEKflox/flox小鼠即为对照小鼠。提取小鼠尾基因组DNA,通过PCR鉴定子代小鼠的基因型;提取小鼠肝脏RNA和总蛋白,利用Real-Time PCR和Western Blotting技术检验DEK基因在小鼠肝脏中的mRNA水平和蛋白质水平的表达情况,使用激光共聚焦检测DEK蛋白在小鼠肝脏的表达情况;对小鼠肝脏行苏木精-伊红染色观察小鼠肝组织的形态学变化。 结果　PCR结果表明子代小鼠基因型符合DEKflox/flox/Alb-Cre;肝脏特异性DEK基因敲除小鼠肝组织中DEK基因的mRNA水平及蛋白质水平显著低于DEKflox/flox型小鼠;肝脏特异性DEK基因敲除小鼠肝组织的形态学特征与对照组小鼠相比无明显差异。 结论　本研究利用Cre/Loxp技术成功构建了肝脏特异性DEK基因敲除小鼠,为在动物水平进一步研究DEK基因的作用提供了重要动物模型。     

DEK蛋白与宫颈癌的研究进展

DEK蛋白是普遍存在于有机体细胞内(酵母茼除外)核蛋白.它与许多肿瘤的形成、自身免疫性疾病和病毒感染有密切关系.目前认为DEK蛋白与染色质结合,改变DNA拓扑结构,影响基因表达.在HPV感染的的宫颈癌细胞中,DEK过表达,且DEK是高致病性HPV病毒原癌基因E7的上调目标.DEK与p53、caspase家族相互作用,抑制HeLa细胞衰老和凋亡.     

DEK蛋白在星形细胞肿瘤组织中的表达及意义

目的:探讨DEK蛋白表达与星形细胞肿瘤发生、发展的关系。方法:免疫印迹杂交法检测DEK蛋白在星形细胞肿瘤组织及正常脑组织中的表达水平。结果:DEK蛋白表达阳性率在肿瘤组织中为93.75%,DEK蛋白相对含量分别为:低级别肿瘤组织0.55±0.11,高级别肿瘤组织0.85±0.07;DEK蛋白在肿瘤组织中的表达显著高于其在正常脑组织中的表达（P<0.05）。结论:DEK蛋白表达与星形细胞肿瘤的发生、发展呈显著正相关,是评估星形细胞肿瘤恶性生物学行为的可靠指标。DEK作为凋亡抑制基因为星形细胞肿瘤的治疗提供了一个新靶点。     

星形细胞肿瘤DEK的表达及其与病理分级的关系

目的:检测星形细胞肿瘤组织中DEK的表达,分析其与病理分级之间的关系。方法:应用免疫组化技术并用图像分析系统检测各级别星形细胞肿瘤组织及脑组织中DEK的表达水平。结果:各组免疫组化染色阳性率分别为:肿瘤组织（86.6%）,其中毛细胞型星形细胞瘤(WHO I级66.7%),弥漫性星形细胞瘤（WHO II级84.2%）,间变性星形细胞瘤（WHO III级93.3%）,胶质母细胞瘤（WHO IV级100.0%）;脑组织（33.3%）。各组免疫组化染色强度分别为:肿瘤组织 23.57±8.12,其中毛细胞型星形细胞瘤14.23±5.31,弥漫性星形细胞瘤19.52±6.68,间变性星形细胞瘤32.12±13.56,胶质母细胞瘤36.92±15.61;脑组织11.61±1.85。DEK在肿瘤组织中的表达显著高于其在脑组织中的表达（P<0.05）。结论:DEK的过表达与星形细胞肿瘤的发生密切相关,并且与肿瘤的病理分级也密切相关;DEK表达改变,为星形细胞肿瘤临床诊断、治疗和预后判断提供了新思路。