多重PCR归化法平行检测HBV和HCV的研究

目的：建立一种多重PCR归化法并应用于对HBV、HCV平行检测。方法：利用PCR反应5′端允许添加非互补序列的原理，运用内外两对引物，经过2轮扩增，使目的产物均带上共有序列，再以共有序列为引物进行扩增，实现多重扩增。比较和筛选四种核酸提取方法。运用正交优化法，优化并确定最佳扩增条件。对28份血标本进行对比试验，并进行质量评价。结果：归化多重PCR方法对于HBV、HCV病毒合并感染患者的诊断敏感性为83.5%，诊断特异性为70.0%，诊断指数为153．3％，诊断效率为72．2％；对HBsAg阳性患者的HBV DNA的诊断敏感性为78．6％，诊断特异性为80．0％，诊断指数为158．6％，诊断效率为79．2％。对抗－HCV阳性患者的HCV RNA的诊断敏感性为75．0％，诊断特异性为90．0％，诊断指数为165．0％，诊断效率为83．3％。结论：多重PCR归化法在多基因扩增或多种病原体的同时平行检测领域具有较大应用潜力。该方法实用、准确、可靠，对HBV HCV的防治具有实际意义。     

慢粒白血病abl癌基因表达的研究

选择分别位于ｂｃｒ／ａｂｌ嵌合基因的Ｍｂｃｒｌ第二外显子和ａｂｌ的第二外显子上的两条引物，对１８例慢粒白血病及２例急淋白血病标本进行逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）检测。结果：在１８例包括ｐｈ（＋）和ｐｈ（－）不同病期的慢粒白血病患者血中均检出ｂｃｒ／ａｂｌ嵌合基因的表达，其中１４例为Ｋ－２８型表达，１例为Ｌ－６型表达，３例为Ｋ－２８型，Ｌ－６型同时表达；２例急淋白血病标本中１例为Ｋ－２８型表达。研究结果表明，１．ｂｃｒ／ａｂｌ嵌合基因是慢粒白血病的一个重要分子生物学特征；２．ｐｈ（＋）和ｐｈ（－）慢粒白血病的分子生物学基础相同，即均有ｂｃｒ／ａｂｌ嵌合基因；３．至少部分急淋白血病与慢粒白血病有相同的分子生物学基础；４．ｂｃｒ的断裂点位置可能有一定的临床意义，但有待进一步研究；５．同时表达Ｌ－６型和Ｋ－２８型的情况多见于急变区，此现象提示体内可能同时有两类不同嵌合的白血病细胞或白血病急变期ｂｃｒ出现新的重排。     

利用寡核苷酸芯片检测乙型肝炎病毒基因突变

目的　利用寡核苷酸芯片平行分析乙肝病毒表面抗原区S、前核心抗原pre C区、X区、聚合酶P区 12个已知的突变位点。方法　针对S、pre C、X、P区的 12个突变位点 ,设计位于乙肝病毒反义链的 2 4条寡核苷酸探针和两对PCR引物 ,探针长度为 14～ 18bp ,其 5′端连有氨基己烷和T15间隔子 ,合成后经点样仪点到醛基化玻片上。两对PCR引物分别用于扩增S与P区内的 5个突变位点和X、前C区内的 7个突变位点 ,其中上游引物含有荧光标记。不对称PCR扩增所得到的荧光标记的单链DNA与寡核苷酸阵列杂交、清洗后经扫描分析实验结果。结果　在对 12个乙肝阳性样品前核心抗原C和X区的突变检测中 ,存在 176 2A→T ,176 4G→A联合突变的有 2例、1896G→A突变的 3例、同时存在 176 2A→T、176 4G→A联合突变和 1896G→A突变的 1例、未存在任何突变的样品 6例。在 12个乙肝阳性样品的表面抗原S的突变检测中 ,未发现有突变出现。部分样品的随机测序结果与寡核苷酸阵列杂交结果一致。结论　寡核苷酸芯片适于快速、平行、大量检测突变     

检测HSV等5种病原体抗体的微阵列技术

目的 建立抗原微阵列技术检测多种病原体抗体。方法 将病原体的基因工程抗原，以电脑操纵的机械手将其点在赖氨酸修饰的玻片上．制备抗原微阵列，与血清反应后随之与Cy3标记的二抗反应，用激光共聚焦扫描仪扫描玻片，检测血清中相应病原体的IgG，并进行了灵敏度和重复性的检测。结果 5种抗原的最低检测限度为HSV1-gG 1．56μg／ml，HSV2-gG 3．125μg／ml，CMV-p150 1．56μg／ml，RV-E1E2 3．125μg/ml，MT-EAM 31．26μg／ml；抗原微阵列与ELISA检测的结果相比有较高的符合率；检测IgG和IgM的灵敏度分别为50pg、10pg；不同批次2张玻片间总体变异系数为IgG 6．52，IgM 18．89。结论 抗原微阵列可用于平行检测血液中病原体特异性抗体。     

丁型肝炎病毒核酶反式切割HBV mRNA片段的实验研究

目的　探讨反式作用丁型肝炎病毒 (HDV)核酶体外切割乙型肝炎病毒 (HBV)mRNA片段的可行性。方法　将化学合成的核酶cDNA克隆到含有T7启动子的载体PGEM 4Z中。利用体外转录技术转录出核酶及底物 ,研究其体外切割活性。利用E H作图法进行核酶的酶促动力学研究。结果　在体外实验中显示两酶均能成功的将底物切割 ,37℃温浴 90min的切割百分率为 5 0 %和5 1%。利用E H作图法进行的酶促动力学研究中求得Rc1、Rc2的Km值分别为 0 6 1μmol L、0 5 8μmol L,Kcat值分别为 :0 6 4·min 1 、0 6 0·min 1 。结论　反式作用HDV核酶对非HDV底物 HBVmRNA片段的成功切割为寻找新的HBV的反义抑制手段开辟了途径。     

中国肿瘤分子生物学研究的现状及述评

对中国肿瘤分子生物学的研究近况进行综述，讨论了我国肿瘤分子生物学研究已取得的进展和有待改进的方面，提出了应进行系统化研究的建议。     

荧光定量RT-PCR在轮状病毒检测中的应用

目的:建立轮状病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,用于检测临床腹泻样本。方法:使用Taqman探针技术,建立轮状病毒VP6特异的荧光定量RT-PCR体系。与WHO推荐的轮状病毒检测方法ELISA平行检测,对该体系的检测范围、灵敏度、特异性等参数进行评价。并将该体系用于临床腹泻样本。结果:该荧光定量RT-PCR体系具有高度灵敏度和特异性,线性范围宽,最低可检出1TCID50/ml。对113份临床腹泻样本的平行检测结果显示,该荧光定量RT-PCR体系与ELISA的检出率差异无统计学意义(χ2=0.41,P>0.5),可同样用于临床样本检测。结论:成功建立了轮状病毒荧光定量RT-PCR体系,该体系灵敏、特异、重复性好,可用于临床检测。     

口腔常见厌氧性细菌感染检测基因芯片的研制

目的研制一种用于检测口腔常见无芽胞厌氧性细菌感染的基因芯片。方法选择口腔感染中常见的无芽胞厌氧性细菌作为菌种,将16S rDNA作为靶基因。借助生物信息学方法,设计通用引物和特异性探针,选择与反义引物互补的核酸序列作为阳性质控探针;大肠杆菌16S rDNA基因序列为阴性质控探针,制备微阵列。进行厌氧性细菌DNA的提取、扩增、杂交、结果分析以及微阵列质量检测。结果制备的用于检测口腔常见无芽胞厌氧菌感染的基因芯片特异性、灵敏度、重现性和稳定性均符合实验要求。结论利用生物信息学方法设计的引物和探针合理,制备的芯片可用于口腔常见无芽胞厌氧性细菌感染的诊断。     

制备蛋白质微阵列的玻璃表面修饰方法比较

目的 探讨用于制备蛋白质微阵列的5种不同修饰方法的玻片对蛋白质的固定能力，通过对荧光信号强度的大小以及蛋白芯片检测的灵敏度的比较确定一种蛋白质固定效果好、信噪比高的玻片。方法 将系列稀释的人IgG分别点在5种不同修饰方法[包括氨基、多聚赖氨酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APES）、醛基-磷酸盐缓冲液、醛基-H2O]修饰的玻片上制备蛋白质微阵列，比较不同玻片修饰方法荧光信号强度的大小以及蛋白芯片检测的灵敏度。结果 5种玻片中APES修饰的玻片蛋白质固定效果最好，信噪比最高。结论 APES修饰的玻片比较适合制备蛋白质微阵列。     

PCR技术在脑脊液病原菌诊断中的应用

本文概述以PCR技术为代表的各种分子生物学诊断技术 ,在中枢神经系统感染的病原菌检测中的初步应用与展望