体外培养牙周膜细胞增殖分化与中药双黄补水提液的调控效应

背景:牙周组织的修复再生取决于牙周膜细胞的数量和增殖分化能力。牙周膜细胞具有多向的分化潜能,可分化成成牙骨质细胞、成骨细胞和成纤维细胞,形成牙骨质、牙槽骨和牙周膜,实现牙周组织再生。目的:观察体外培养人牙周膜细胞增殖和分化过程中传统中药双黄补水提液对其功能的影响。设计:观察性实验。单位:无锡市第三人民医院中心实验室。材料:牙周膜组织(由健康青少年患者因矫正畸形门诊就诊时自愿提供);黄连、黄岑、骨碎补(中国药品检定所提供)。方法:实验于2003-07/10在无锡市第三人民医院中心实验室完成。分别将粉碎的黄连、黄岑、骨碎补和蒸馏水1∶10(m∶V)混合,沸水回流5h。收集提取液,粗滤后残渣再次沸水回流3h。合并2次提取液,旋转蒸发浓缩,所得中药水提液浓度为3kg/L。分黄连组、黄芩组、骨碎补组、黄连加黄岑组、黄连加骨碎补组、黄岑加骨碎补组、双黄补组和对照组8组进行实验。通过体外培养人牙周膜细胞,应用双黄补提取液作为辅助因子,采用MTT比色法测定细胞增殖情况,羟脯氨酸法测定胶原蛋白占总蛋白比值。主要观察指标:牙周膜细胞增殖的吸光度值及胶原蛋白占总蛋白的比值。结果:①牙周膜细胞增殖的测定结果:除黄连组外其他各组均明显促进人牙周膜细胞增殖,与对照组比较,差异明显(P<0.05)。双黄补组细胞的吸光度值增大最为明显。随着作用时间的延长,细胞的吸光度值逐渐增大,在第5天达到最大。不同时间各组间比较,差异有显著性意义(P<0.05)。②各组牙周膜细胞胶原蛋白占总蛋白的比值:除黄连组外其他各组均明显促进比值增大,与对照组比较,差异明显(P<0.05)。双黄补组比值增大最为明显。随着作用时间的延长,比值逐渐增大,在第5天达到最大。不同时间各组间比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:双黄补水提液可明显促进人牙周膜细胞增殖,明显提高胶原蛋白在总蛋白中的比值,可作为人牙周膜细胞增殖的理想的中药辅助因子。     

脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞向神经样细胞分化

背景：体外培养条件下脐血间充质干细胞可向神经样细胞诱导分化,一定浓度范围的脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子联合体外诱导可获得较高的神经元分化比例。 目的：观察脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞分化成神经样细胞的可行性。 方法：取第5代的脐血间充质干细胞,分别用5,10,20 μg/L的脑源性神经营养因子和5,10,20 μg/L睫状神经营养因子单独或联合诱导脐血源间充质干细胞向神经样细胞分化,另设空白对照组无任何干预措施。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于实验第1,3,6天分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色,并计数分化为神经元样细胞及神经胶质细胞的比例。 结果与结论：①向神经细胞诱导后,人脐血源间充质干细胞形态明显改变,胞体收缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构。②与空白对照组相比,脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子能显著提高人脐血源间充质干细胞分化为神经元的比例。其中20 μg/L的脑源性神经营养因子联合20 μg/L睫状神经营养因子诱导人脐血源间充质干细胞分化为神经样细胞的比例最高。提示人脐血间充质干细胞经脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子体外诱导,均能够分化为神经样细胞。     

体外诱导胎盘来源间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探索体外诱导胎盘间充质干细胞(PMSCs)分化为神经元样细胞的方法。方法:消化胎盘组织,贴壁培养细胞,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含叔丁对甲氧酚(BHA)、二甲基亚砜(DMSO)及碱性成纤维细胞因子(b-FGF)的条件培养基培养细胞,诱导分化为神经元样细胞,采用免疫细胞化学的方法对分化的细胞进行鉴定。结果:胎盘组织的贴壁细胞与骨髓间充质干细胞(BMSCs)有相似形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星形胶质细胞标志神经元特异性的烯醇化酶(NSE)、和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论:胎盘组织中存在能分化为神经元样细胞的间充质干细胞。     

人脐血间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨来源于人脐血的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化成神经元样细胞的可行性，以及在体外分离、纯化和扩增的条件。方法 无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血，经肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化，获得贴壁细胞，取扩增第三代后的MSCs向神经元样细胞诱导分化。用免疫荧光标记方法检测神经元特异性标记物。结果 来源于脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后，可产生贴壁细胞，主要表现为破骨样和间充质样细胞；传3代后，这些细胞可得到纯化、扩增；免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论 源于脐血的MSCs在体外可以培养、扩增，并向神经元样细胞分化，可作为神经干细胞的来源而用于实验研究和临床。     

不同胚龄人神经干细胞的分离和培养

目的 探索不同胚龄人神经干细胞分离和培养的适宜条件。方法 在多种培养条件下，采用无血清培养和单细胞克隆技术，从7周和13周人胚脑中分离和培养神经干细胞，应用免疫荧光染色予以鉴定。结果 从两个不同胚龄的人胚脑中分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，未包被组7周的人胚脑除高密度县浮培养法生长不良，其它密度及培养法均有克隆球形成；13周的人胚脑仅中等密度悬浮培养法及高密度贴壁培养法有克隆球形成；包被组各种密度培养均生长不良。结论 人胚脑中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞，随着胚龄增大，培养难度逐渐加大，高密度贴壁培养法适宜各胚龄神经干细胞的分离培养。     

双黄补对牙周病中牙周膜细胞的增殖分化的调控

目的:探讨中药双黄补对体外培养的人牙周膜细胞(PDLC)增殖和分化的影响。方法:通过体外培养人PDLC,应用双黄补提取液作为辅助因子分成8组:A·黄连;B·黄芩;C·骨碎补;D·黄连加黄岑;E·黄连加骨碎补;F·黄岑加骨碎补;G·黄连、黄芩、骨碎补;H·对照组。采用MTT比色法测定细胞增殖情况,羟脯氨酸法测定胶原蛋白比值。结果:各组药物提取液均有促进PDLC增殖和提高胶原蛋白比值的作用,与对照组比较,差异有显著性,其中以双黄补组的效果最明显。不同孵育时间培养中以第5天的作用最强。结论:双黄补水提液可明显促进人PDLC增殖,明显提高胶原蛋白在总蛋白中的比值,可作为PDLC增殖的理想的辅助因子。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养和向神经细胞分化的研究

目的　分离骨髓后培养人骨髓间充质干细胞 (hMSCs) ,进行体外传代扩增 ,并探索体外诱导分化为神经元样细胞的方法。方法　抽取人骨髓血 ,percoll paque液 (1 0 73g/ml)分离 ,DMEM/2 0 %FCS培养传代 ,至第 3～ 5代时加入巯基乙醇 (BME) ,观察hMSCs分化为神经元样细胞的形态学变化。结果　hMSCs在体外可以实现数目扩增 ,在特定诱导剂的作用下向神经元样细胞分化。结论　采用少量骨髓样本 ,经培养获得充足的细胞量 ,满足定向诱导和细胞移植的需要。     

骨髓间充质干细胞白体移植促进兔缺血肢体的血管生成

背景：常规药物治疗、介入或血管旁路移植手术对下肢动脉闭塞症的远期疗效均不理想。近年来采用于细胞的血管再生疗法在梗死部位修复或重新建立有效侧支循环逐渐成为可能。目的：验证骨髓间充质干细胞自体移植对兔缺血后肢血管再生的促进作用。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005—08／2006-11在江苏省血吸寄生虫病防治研究所完成。材料：选用新西兰大白兔8只，制备兔后肢缺血模型。按随机数字表法分为2组，实验组及对照组各4只。方法：分离培养实验组兔骨髓间充质干细胞，5-溴-2-脱氧尿苷标记，将骨髓间充质干细胞制成悬液注射于实验组兔后肢缺血部位；对照组注射等量生理盐水。主要观察指标：2周后行兔股动脉二维及彩色多普勒超声检测，观察移植前后的血管内径、血流峰值速度及血流加速时间等；取缺血部位肌肉组织，通过免疫荧光及苏木精伊红染色观察移植细胞分布及血管生成情况。结果：细胞移植2周后实验组免的股动脉内径、血流峰值速度均大于对照组（P〈0．01），血流加速时间短于对照组（P〈0．01）。免疫荧光染色结果显示实验组兔移植部位有抗5溴-2-脱氧尿苷染色阳性细胞存在；苏木精-伊红染色结果显示实验组缺血部位血管密度高于对照组。结论：骨髓间充质干细胞具有促进血管生成的作用，自体移植可望成为一种简单的、有效的治疗下肢缺血的方法。     

人脐带血间充质干细胞的体外培养及其影响因素

背景:多潜能间充质干细胞在特定的培养条件下可以分化为骨、脂肪、软骨、肌肉以及内皮细胞,是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞。目的:建立人脐带血来源的间充质干细胞体外培养、扩增的方法,并分析其影响因素。设计:随机对照实验。单位:无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室。材料:健康新生儿脐带血(来源于无锡第三人民医院妇产科临产室,均征得产妇及其家属同意)70例,每例40mL;低糖基本必需培养基(Gibco),胎牛血清(Gibco),青链霉素(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),FITC标记的小鼠抗人CD29、CD105、CD106(Ancell)单克隆荧光抗体和PE标记的小鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD19、HLA-DR(Immunotech)单克隆荧光抗体,Ficoll分离液(Pharmacia)。方法:实验于2005-02/2005-12在无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室完成。①脐血间充质细胞的分离培养:健康新生儿脐带血共70例肝素(25u/mL)抗凝,分离单个核细胞,其中60例沉淀细胞用细胞培养液(低糖基本必需培养基 50g/L胎牛血清 10g/L青链霉素)重悬,另10例用高糖基本必需培养基重悬(其余培养条件相同)。细胞长到80%融合时,以1.0×107个/L的密度接种于培养瓶中进行扩增培养。②胎牛血清包被对人脐血间充质干细胞贴壁率的影响:取生长状态良好、纯化后对数生长期的人脐血间充质干细胞,分为血清包被组和无血清包被组,分别观察其贴壁率。③间充质干细胞的形态学和生长曲线:在相差显微镜(OLYMPUS CK40)下观察细胞生长状况,数码成像系统(OLYMPUS DP50)摄像记录。④免疫表型:取扩增第5代的脐血间充质干细胞,用EPICS-ALTRA流式细胞仪进行检测。主要观察指标:①观察高糖组和低糖组细胞的生长状态。②观察不同时间点胎牛血清包被组与未包被组细胞的贴壁情况并分别计算贴壁率。结果:本实验总共培养和分析了70例脐血间充质干细胞样本。由于10例予含高糖的培养基培养的标本均未获得理想的间充质干细胞,故未进行统计学分析。①按照本实验所建立的培养体系,约20%的样本成功培养出脐血间充质干细胞。原代细胞在培养2周后可达到融合,一般其倍增时间为3～4d,传代后7～8d即可达到融合。②扩增至第5代的间充质干细胞结果显示,脐血间充质干细胞均一稳定地表达间充质干细胞相关的抗原标记:CD29,CD44,CD105,但不表达CD34,CD45,CD106,HLA-DR,这与源于骨髓的间充质干细胞的表面抗原标记相一致。③血清包被组间充质干细胞贴壁率显著高于无血清包被组(P<0.01)。结论:脐带血中的间充质干细胞可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源。高糖可能抑制人脐血间充质干细胞的生长和扩增。     

人脐血间充质干细胞移植促进大鼠颅脑创伤后神经功能的恢复

目的 将人脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)注射到创伤性脑损伤(TBI)大鼠顶叶皮层及海马区,观察神经细胞标志物的表达和促进神经功能的恢复.方法 HUCB-MSCs用双苯酰亚胺(bis-benzimide)标记24 h,通过立体定向将细胞注射到损伤脑组织内.全部大鼠分为假损伤组、损伤组(TBI)、对照组(TBI+PBS)和治疗组(TBI+MSCs).用免疫组化和免疫荧光标记的方法检测移植细胞的存活、迁移和分化情况,用神经损伤严重程度评分(NSS)对神经功能恢复结果进行评价.结果 在接受移植的脑创伤大鼠局部有大量的MSCs存活,一些细胞分化为神经元或神经胶质细胞,并表达NSE和GFAP等神经细胞的标志物,治疗组的神经功能评分较其他组有明显的改善.结论 HUCB-MSCs可明显改善脑创伤后神经功能的恢复,并能很好替代骨髓MSCs而用于干细胞移植.