三七几丁质酶基因PnCHI1的功能分析

几丁质酶(chitinase)是一种能够将几丁质水解成N-乙酰葡糖胺的糖苷酶,广泛存在于植物细胞中,是抗真菌防卫反应体系的重要组成部分。该文深入分析了1种三七几丁质酶基因PnCHI1的功能。构建PnCHI1的亚细胞定位载体,转入洋葱表皮细胞中瞬时表达,在激光扫描共聚焦显微镜下发现PnCHI1定位于细胞壁中。构建PnCHI1的原核表达载体,诱导并纯化获得重组蛋白,体外平板抑菌实验结果显示PnCHI1原核重组蛋白对尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、轮枝镰刀菌3种三七根腐病菌的菌丝生长具有很强的抑制活性。采用反向遗传学技术验证PnCHI1的功能,通过根癌农杆菌介导将PnCHI1转入烟草中过量表达。qRT-PCR分析结果表明PnCHI1在T2代转基因烟草中大量表达,同时叶片接种实验显示PnCHI1转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性增强明显。结论:PnCHI1是定位于细胞壁的几丁质酶,体外能抑制几种三七根腐病真菌,在烟草过表达大大提高了烟草对茄腐镰刀菌的抗性,推测PnCHI1是三七中参与根腐病防卫反应的重要抗病基因。     

三七几丁质酶基因PnCHI1的克隆及表达特性分析

几丁质酶(chitinase,EC3.2.1.14)广泛存在于多种生物体中,催化水解几丁质(chitin),在抗真菌防卫反应体系中具有重要作用,同时几丁质酶还调控植物的生长和发育,参与细胞的程序性死亡(programmed cell death,PCD)。该实验基于三七Panax notoginseng中编码几丁质酶的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到1个新的几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为PnCHI1。PnCHI1的cDNA全长为1 022 bp,含有822 bp的开放阅读框,26 bp 5'-非翻译区以及174bp的3'-非翻译区,编码具有273个氨基酸的蛋白质。该基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族成员,进化树分析表明PnCHI1编码的氨基酸序列属于IV类几丁质酶。qRT-PCR分析结果显示,植物信号分子水杨酸、茉莉酸甲酯、H_2O_2和乙烯处理可均明显诱导三七根中PnCHI1的转录水平;三七叶片接种人参链格孢Altemaria panax后,PnCHI1的表达量迅速升高,呈波动上升趋势;外源茉莉酸甲酯预处理三七根部,PnCHI1的表达水平上升,接种茄腐镰刀菌Fusarium solani后,PnCHI1的转录水平急剧上升,接种后4 h达到最高转录水平;而无菌水预处理三七受茄腐镰刀菌侵染过程中,PnCHI1的表达量逐渐上升,至48h达到最大值。上述结果表明PnCHI1参与三七对根腐病菌以及黑斑病菌的防卫反应。