金铁锁不同居群rDNA ITS序列分析

目的分析金铁锁不同居群的核糖体ITS碱基序列,为鉴别不同产地金铁锁提供分子依据.方法使用1对引物18P1和26P2进行ITS基因的PCR扩增并测序.结果12个居群金铁锁的ITS1片段长度为225~229 bp,ITS2片段长度为166~170 bp,5.8S片段长度为261~264 bp.云南昆明、丽江、个旧、鹤庆和四川盐源5个居群的ITS序列碱基完全一致,云南宣威、会泽、中甸、保山、四川木里、西藏林芝等7个居群的ITS序列则有不同的变化,碱基变异数目(包括5.8 S编码区)为1~4个.结论经过比较分析,rDNA ITS区碱基序列在分布于云南中部、四川西南端等居群与云南西部、西北端、西藏东南部、四川西南部居群具有各自相应的指纹特征,可以作为相应居群的鉴别依据.     

金铁锁鲨烯合酶cDNA的克隆和功能鉴定

濒危药用植物金铁锁(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu.)的有效成分三萜总皂苷有显著的药理活性。为克隆和鉴定金铁锁三萜皂苷生物合成途径中的关键酶基因——鲨烯合酶的全长cDNA，本研究采用同源兼并引物PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆了其全长cDNA；结合大肠杆菌异源表达、体外酶促反应及针对产物化学结构的GC和GC-MS分析等方法鉴定了其功能。研究结果表明：金铁锁鲨烯合酶cDNA全长为1 663 bp，含有1 245 bp的开放阅读框(ORF)，编码414个氨基酸(计算分子质量为47.69 kD)，5′非编码区(UTR)和3′UTR分别为260 bp和158 bp，GenBank注册号为EF585250，与三七、人参和甘草的鲨烯合酶的氨基酸序列有较高的同源性，分别为83%、 82%和82%，而与裂变酵母、白色念珠菌和人的氨基酸序列的同源性分别只有35%、 39%和47%；表达产物具有催化两分子法呢烯焦磷酸连接成鲨烯的活性。本研究克隆和鉴定了金铁锁鲨烯合酶的全长cDNA，为金铁锁次生代谢工程研究提供了重要基础。     

构建酿酒酵母细胞工厂生产番茄红素

为构建高效生产番茄红素的酿酒酵母细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母中引入番茄红素生物合成途径基因Crt B和Crt I,获得能生产0.17 mg·L-1番茄红素的初始工程菌ZD-L-000。在此基础上,在工程菌ZD-L-000中分别过表达MVA途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因t HMG1、萜类合成调控的转录因子编码基因upc2.1、二萜生物合成的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶与法呢基焦磷酸合酶编码基因BTS1-ERG20,以及来自嗜酸热硫化叶菌的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因Sa GGPS,考察这些基因过表达对番茄红素合成的影响,结果发现过表达upc2.1基因未能提高番茄红素的产量,但过表达t HMG1、BTS1-EGR20和Sa GGPS基因均能显著提高番茄红素的产量,分别为初始菌株的2.0,16.9和20.5倍。在进一步研究中,t HMG1、BTS1-EGR20和Sa GGPS等有效基因被一同整合入工程菌ZD-L-000,获得的高产菌株ZD-L-201中番茄红素的产量提高77.0倍,达到13.23 mg·L-1;在高密度-两相发酵体系中工程菌ZD-L-201的番茄红素产量能进一步提高到135.21 mg·L-1(提高10.2倍)。本研究获得的工程菌为微生物发酵法生产番茄红素提供了基础。     

高产橙花叔醇的酵母细胞工厂创建

橙花叔醇为萜类精油成分,具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学活性。为了实现在酿酒酵母中异源生产橙花叔醇,该研究首先将猕猴桃Actinidia chinensis来源的橙花叔醇合酶(NES)基因通过密码子优化、人工合成后转入底盘菌株FPP-001中获得工程菌株NES-001,其橙花叔醇产量达到2.71 mg·L~(-1)。在进一步工作中,橙花叔醇合酶的N端通过连接肽GGGS融合法尼烯合酶(FPS)后得到橙花叔醇产量显著提高的工程菌NES-002,其产量是NES-001的59.80倍,达到162.07 mg·L~(-1)。最终,通过恢复NES-002中色氨酸生物合成缺陷基因TRP1得到工程菌NES-003,该菌在高密度发酵体系中橙花叔醇产量能达到1 711.53 mg·L~(-1)。该研究为微生物发酵法生产橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基础。     

常春藤皂苷元生物合成解析及酵母细胞工厂的构建

常春藤皂苷元为威灵仙等药用植物的有效成分,在抗肿瘤、抗炎、抗抑郁、保肝、抑菌等方面有较好的药理活性。为获得高效生产常春藤皂苷元的酿酒酵母细胞工厂,该研究首先利用即插即用生物合成途径解析平台,在蔷薇科植物苹果Malus×domestica中成功筛选获得能催化齐墩果酸C-23位氧化的P450氧化酶基因Md MA02,其氨基酸同源性仅为已知活性的CYP72A68v2基因的32%。工程菌BY-OA-Md MA02经高密度发酵优化,其生产常春藤皂苷元产量能达到101 mg·L~(-1),是摇瓶发酵的337倍。该研究为推动齐墩果烷型五环三萜生物合成途径解析及常春藤皂苷元高效细胞工厂的创建提供了基础。     

金铁锁种质资源的遗传多样性分析

目的研究中国西南特有濒危药用植物金铁锁的遗传多样性。方法应用AFLP分子标记技术对具有代表性的7个金铁锁居群,共137个个体进行分析。结果在金铁锁的物种水平上,Nei’s基因多样性指数(He)、Shan-non’s信息指数(I)、多态位点百分率(PPB)分别为0.2434±0.1791、0.3735±0.2485、82.30%;在其居群水平上分别为0.0918±0.1610、0.1402±0.2362、30.48%。居群间Nei遗传分化指数(Gst):0.6244;Shannon’s多样性基因遗传分化系数(Ist):0.6246。聚类表明:地理距离相对远的丽江居群与个旧居群遗传距离最近;昆明居群与其他居群遗传距离较远。统计获得9条可区分各地方居群的特征指纹带。结论金铁锁种内的遗传多样性水平丰富,而居群内遗传多样性水平较低,居群间遗传分化显著;各居群间亲缘关系与地理距离无明显相关性;其种内特征带与各居群特征带结合,可以为AFLP分子标记技术用于其种质资源的鉴定、遗传育种提供重要的依据。     

创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产芳香精油瓦伦烯

瓦伦烯是一种具有柑橘气味的倍半萜类化合物,常被用于化妆品和食品添加剂,以及工业合成诺卡酮。本研究拟用合成生物学技术创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产瓦伦烯。首先,在底盘细胞YTT-T5中引入北美金柏来源的瓦伦烯合酶(Cn VS),成功获得可生产1.1 mg·L^-1瓦伦烯的工程菌VAL-01;采用蛋白质融合技术,不同植物来源的瓦伦烯合酶筛选,并调整了关键基因拷贝数后,瓦伦烯产量提升至436.4 mg·L^-1。进一步工作中,删除转录因子ROX1,瓦伦烯的产量提高了17.4%。最后,对半乳糖诱导系统进行调控,并过表达多药耐药性调控因子PDR3和调控内质网大小转录因子INO2,所得工程菌株VAL-10经高密度发酵能生产2 798.6 mg·L^-1瓦伦烯(产量是初始菌株的2 500倍),为瓦伦烯绿色生产提供了基础。     

金铁锁种质资源的遗传多样性分析

目的研究中国西南特有濒危药用植物金铁锁的遗传多样性。方法应用AFLP分子标记技术对具有代表性的7个金铁锁居群,共137个个体进行分析。结果在金铁锁的物种水平上,Nei’s基因多样性指数(He)、Shan-non’s信息指数(I)、多态位点百分率(PPB)分别为0.2434±0.1791、0.3735±0.2485、82.30%;在其居群水平上分别为0.0918±0.1610、0.1402±0.2362、30.48%。居群间Nei遗传分化指数(Gst):0.6244;Shannon’s多样性基因遗传分化系数(Ist):0.6246。聚类表明:地理距离相对远的丽江居群与个旧居群遗传距离最近;昆明居群与其他居群遗传距离较远。统计获得9条可区分各地方居群的特征指纹带。结论金铁锁种内的遗传多样性水平丰富,而居群内遗传多样性水平较低,居群间遗传分化显著;各居群间亲缘关系与地理距离无明显相关性;其种内特征带与各居群特征带结合,可以为AFLP分子标记技术用于其种质资源的鉴定、遗传育种提供重要的依据。     

论中药资源可持续发展的现状与未来

中药资源是中医药的物质基础,几千年的积累为人们的生产生活提供了丰富的药物基础保障,近年来,随着社会的发展、需求量的不断增大,加之对合理开发利用中药资源的认识不足,使中药资源的可持续发展和利用陷入困境,中药材质量难以保障、中药传统文化精髓丢失、自然环境承受巨大压力等问题严重制约了中医药事业的发展,该文介绍了针对这些问题科学工作者们在中药资源普查、道地药材形成机制研究、中药材新品种培育、珍稀濒危中药材替代品的研究及合成生物学应用于中药活性成分研究等方面所做的工作,并对中药资源未来的发展方向提出几点建议。     

动态调控酿酒酵母ERG20基因表达提高单萜化合物的生产北大核心CSCD

单萜类化合物被广泛应用于化妆品、食品、医药、农业等领域。随着合成生物学的发展,利用合成生物学技术创建"微生物细胞工厂"进行单萜类化合物生产被认为是一种非常有潜力的方式。然而,在酿酒酵母中牻牛儿基焦磷酸(GPP)和法尼基焦磷酸(FPP)是由一种双功能酶法尼基焦磷酸合成酶(ERG20基因编码)连续催化产生,而且ERG20更加倾向于合成酵母生长必需的FPP,因此合理控制FPP合成是在酵母细胞工厂中实现单萜高效合成的基础。为了实现酿酒酵母工程菌中生物合成GPP到FPP的动态节流,该研究应用基因编辑技术将底盘菌HP001的ERG20的启动子替换为环氧鲨烯环合酶(ERG1基因编码)启动子pERG1,获得新型单萜底盘菌HP001-pERG1-ERG20。进一步,分别利用以GPP和橙花基焦磷酸(NPP,cis-GPP)为底物的生物合成途径对底盘菌生产能力进行了验证,其中以GPP为前体的芳樟醇产量达到7.6 mg·L^(-1),提升了42.5%;以NPP为前体的橙花醇的产量达到8.3 mg·L^(-1),提升了1436.4%。该研究为微生物发酵法生产单萜化合物提供了基础。