胶原海绵复合新生大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织

目的:探索以胶原海绵为支架、新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞,于体外构建工程化心肌组织的方法。方法:实验于2005-12/2006-11在解放军第四军医大学西京医院心内科实验室完成。Ⅰ型胶原海绵剪切成方形片状(2.0cm×1.4cm×0.2cm),经60Co照射消毒,于DMEM培养液中水化1h左右。另取1d龄SD大鼠心脏,剪成小碎块,然后用2.5g/L胰蛋白酶于37℃中消化,吸取上清至含胎牛血清的DMEM中,重复消化四五次,用差速贴壁法除去大部分成纤维细胞,将细胞沉淀用DMEM培养液以2×109L-1的密度悬浮备用。将上述的心肌细胞悬液1mL缓慢滴注于玻璃模型中的胶原海绵上,然后置于细胞培养中培养。肉眼及显微镜主要观察工程化心肌组织在培养期间的自发收缩情况,包括收缩的部位、强度、频率、一致性以及收缩随时间变化的情况。苏木精-伊红染色观察工程化心肌组织内胶原纤维的变化,细胞形态,胞核的形状及细胞之间的连接。免疫组织化学染色和透射电镜观察工程化心肌组织片的形态和功能。结果:①细胞接种于胶原海绵上1d后,细胞/胶原复合物的凝胶化过程基本完毕,体积保持恒定,维持至培养结束,第3天细胞/胶原复合物局部出现点片状自发收缩,第5天整个细胞/胶原复合物出现同步化自发收缩,收缩频率61～199次/min。2周后37.5%的工程化心肌组织的自发收缩活动减弱,但75%的工程化心肌组织的自发收缩活动持续至培养结束。②苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色和透射电子显微镜显示,工程化心肌组织内细胞间连接广泛存在,细胞多呈纵向分布,胞核呈长圆形,胞浆内α-肌节肌动蛋白阳性,胞内肌原纤维排列整齐,可见到心肌特异性的肌小节结构和Z线,多数细胞具有分化的心肌细胞表型。结论:用新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞、以Ⅰ型胶原海绵为支架材料,构建出的工程化心肌组织,于体外可长时间持续自发收缩,该细胞/胶原复合物的形态结构与生理功能均类似于成熟大鼠心肌组织。     

大蒜素对血管紧张素Ⅱ诱发人心房肌细胞钙电流和游离钙离子浓度的影响

背景近年来发现血管紧张素Ⅱ可诱发心房电重构,而大蒜素具有相应的拮抗作用,可阻止或减轻心房电重构的发生.目的观察大蒜素对血管紧张素Ⅱ诱发人心房肌细胞膜钙通道电流和细胞内游离钙离子浓度的影响.设计以急性分离的人的心房肌细胞为实验对象,随机对照设计.单位一所军医大学医院心内科. 方法实验于2003-06/2004-06在第四军医大学西京医院心脏内科实验室完成.选择在此期间接受心脏体外循环手术的先天性心脏病患者10例;男6例,女4例,平均年龄(15±6)岁.术中取患者右心耳标本送至实验室后,急性分离单个人心房肌细胞,实验分4组对照组(不加任何干预措施);血管紧张素Ⅱ组加入终浓度为0.1μmol/L的血管紧张素Ⅱ;大蒜素组加入终浓度为50 μmol/L的大蒜素;血管紧张素Ⅱ+大蒜素组大蒜素50 μmol/L与血管紧张素Ⅱ0.1 μmol/L同时加入.采用全细胞膜片钳方法记录L型钙电流;以钙荧光探针荧光指示剂负载,应用激光共聚焦显微镜技术,分别于加入干预药物后即刻与15 min检测游离钙离子浓度变化.主要观察指标各组人心房肌细胞L型钙电流峰值电流密度及钙离子游离钙离子的荧光强度变化率.结果①血管紧张素Ⅱ组人心房肌细胞膜L型钙电流峰值电流密度明显高于对照组[(-12.77±1.61),(-5.78±0.81)pA/pF,P＜0.05).②大蒜素组人心房肌细胞膜L型钙电流峰值电流密度与对照组比较,无明显差异[(-5.69±0.83)pA/pF,P＞0.05].③血管紧张素Ⅱ+大蒜素组人心房肌细胞膜L型钙电流峰值电流密度明显低于血管紧张素Ⅱ组[(-8.75±0.97)pA/pF,P＜0.05).④血管紧张素Ⅱ组人心房肌细胞内游离钙离子荧光强度和游离钙离子荧光强度变化率明显高于对照组和大蒜素组[(2610.1±112.6,(299.2±27.3)%;653.9±42.5,0;639.5±44.7,(-2.2±0.6)%,P＜0.05].血管紧张素Ⅱ+大蒜素组人心房肌细胞游离钙离子荧光强度和游离钙离子荧光强度变化率明显低于血管紧张素Ⅱ组[(1284.9±85.2,(96.5±8.4)%,P＜0.05].结论大蒜素可拮抗血管紧张素Ⅱ致人心房肌细胞膜L型钙电流峰值电流密度的增加,拮抗人心房肌细胞内钙超载,产生减轻心房肌细胞电重构的作用.     

血管紧张素Ⅱ对人心房肌细胞膜钾钙离子电流的作用

观察血管紧张素Ⅱ对人心房肌细胞膜主要离子流的作用,揭示其参与房性心律失常的细胞电生理机制。急性分离单个人心房肌细胞,采用全细胞膜片钳方法记录细胞膜短暂外向钾电流(Ito)、内向整流钾电流(Ik1)和L型钙电流(ICaL)。结果:0.1μmol/LAngⅡ使人心房肌细胞膜Ito峰值电流密度明显下降6.54±0.49pA/pFvs12.65±0.86pA/pF(P<0.05),在-100mV电压下使IK1峰值电流密度显著升高-8.93±1.12pA/pFvs-5.23±0.95pA/pF,(P<0.05),并明显促进人心房肌细胞膜ICaL-12.72±1.69pA/pFvs-5.79±0.84pA/pF(P<0.05)。结论:AngⅡ可促进人心房肌细胞膜IK1及ICaL,抑制人心房肌细胞膜Ito。     

低频脉冲电磁场对CRP作用下大鼠EPC增殖、凋亡及NO分泌的影响

目的观察不同强度、不同作用时间的低频脉冲电磁场对C反应蛋白（CRP）作用下大鼠骨髓来源内皮祖细胞（EPC）增殖、凋亡及NO分泌能力的影响。方法密度梯度离心法获得SD雄性大鼠的骨髓EPC,实验分为10组,即空白对照组、12mg/LCRP组以及CRP+不同强度、不同作用时间（0.2mT2h、4h;0.6mT2h、4h;1.0mT2h、4h;1.4mT2h、4h）低频脉冲电磁场组。MTT法检测CPR对EPC增殖能力的影响,流式细胞仪检测CRP对EPC凋亡率的影响,硝酸还原酶法检测EPC培养液中NO含量的变化。结果与空白对照组相比,12mg/LCRP可明显抑制EPC增殖及NO分泌能力,促进EPC凋亡（P<0.05）,0.6mT4h;1.0mT2h两组EPC增殖、NO分泌能力显著高于CRP组,EPC凋亡显著低于CRP组（P<0.05）。其余各组与CRP组相比无明显差异。结论12mg/LCRP可抑制EPC的增殖及NO分泌,促进其凋亡;0.6mT4h和1.0mT2h电磁场可拮抗CRP对EPC的作用,磁场对CRP环境下EPC的作用无强度及时间依赖性。     

恒磁场对血管紧张素Ⅱ作用下血管平滑肌细胞分泌与表达白细胞介素-6的影响

近年来炎性反应在经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄中的作用受到重视,已证实在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)等因子作用下,损伤动脉中白细胞介素-6(IL-6)等炎性细胞因子产生增加,刺激中膜血管平滑肌细胞(VSMC)向内膜移行、增殖并产生大量细胞外基质,导致冠状动脉介入治疗术后再狭窄[1].已知恒磁场具有抗炎抗氧化、抑制VSMC增生,促进内皮增殖等作用.可用于防治冠状动脉介入治疗术后再狭窄[2～4].我们研究恒磁场对AngⅡ作用下VSMC分泌与表达IL-6的影响,旨在进一步阐明恒磁场对经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄的影响及机制.     

急性冠脉综合征患者外周血MMP-9及CRP的变化及其临床意义

目的观察急性冠脉综合征（ACS）患者外周血中基质金属蛋白酶-9（m atrix m etalloproteases-9,MMP-9）及C反应蛋白（CRP）的水平变化,探讨MMP-9、CRP与ACS发生的关系。方法选取ACS患者39例,采用双抗体夹心ELISA测定血清MMP-9的水平,CRP用免疫散射比浊法检测。结果ACS患者入院即刻血浆MMP-9、CRP水平均显著高于对照组[（66±16）vs（24±11）μg/L,P<0.01;（12.3±9.2）vs（3.5±2.0）mg/L,P<0.01]。ACS组内UA亚组与AM I亚组比较,MMP-9水平显著增高[（78±11）vs（50±14）μg/L,P<0.01],而CRP水平显著下降[（7.2±2.2）vs（18.7±10.7）mg/L,P<0.01]。ACS组患者中MMP-9和CRP水平无明显相关性。结论冠心病患者外周血MMP-9、CRP水平升高。ACS患者中MMP-9和CRP水平无明显相关性。     

牛磺酸对外源性羟自由基诱导心肌细胞凋亡的影响

目的：观察牛磺酸对外源性羟自由基诱导心肌细胞凋亡的影响。方法：采用培养的第2代心肌细胞，随机分面4组：（1）正常对照组：仅用DMEM培养；（2）羟自由基组：OH－终浓度为0．1mmol.L^-1；（3）牛左酸组：牛磺酸终浓度为30mmol.L^-1；（4）牛磺酸＋羟自由基组：牛磺酸30mmol.L^-1 OH-0.1mmol.L。观察心肌细胞存活率和形态学，流式细胞仪双标法检测细胞凋亡率。结果：（1）羟自由基组心肌细胞存活率降低，和对照组比较有显性差异（P＜0．05），牛磺酸＋羟自由基组细胞存活率较羟自由基组高（P＜0．05），（2）Annexin V /PI-细胞即凋亡细胞在羟自由基组有较高的发生率，明显高于其他各组（P＜0．05）；牛磺酸＋羟自由基组的细胞凋亡率显低于羟自由基组（P＜0．05），（3）羟自由基组凋亡心肌细胞呈特征性超微结构。结论：牛磺酸能减轻外源性羟自由基诱导的心肌细胞凋亡。     

Fe~(2+)对人脐静脉平滑肌细胞增殖及分泌基质金属蛋白酶-2的影响

目的探讨Fe2+对高糖预孵育的人脐静脉平滑肌细胞(human umbilical vascular smooth muscle cell,HUSMC)增殖及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)分泌的影响。方法取高糖DMEM培养液培养的原代HUSMC(3~5代),分为空白对照组(加DMEM培养液)、A组(100 mg/L Fe2+培养液)、B组(50 mg/L Fe2+培养液)、C组(25 mg/L Fe2+培养液)、D组(12.5 mg/L Fe2+培养液)、E组(6.25 mg/L Fe2+培养液)。干预24 h后,MTT比色法测定细胞增殖,ELISA检测MMP-2含量,激光共聚焦显微镜测定细胞内Ca2+浓度。结果除E组外其他各Fe2+组促血管平滑肌细胞(VSMC)增殖作用均高于空白对照组(P<0.01),A组、B组作用最强;各浓度Fe2+组MMP-2含量均高于空白对照组(P<0.05);A组细胞内Ca2+荧光强度较空白对照组强(P<0.01)。结论Fe2+能明显促进VSMC增殖,并促进分泌MMP-2,升高细胞内Ca2+浓度。