尿液中外源日本血吸虫小分子DNA片段提取方法的建立与评价

目的　建立尿液中外源添加的日本血吸虫小分子DNA片段提取方法,评价不同方法处理尿液后的提取效果。方法　以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,通过PCR扩增靶序列上的81 bp小分子DNA片段,经测序鉴定后作为拟添加到尿液样本中的外源小分子DNA片段。以SjG28为靶基因设计引物及探针,建立实时荧光定量PCR（qPCR）方法;将外源小分子DNA片段以10为梯度倍比稀释后进行扩增,评价该方法的敏感性;以日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、巴贝虫、十二指肠钩口线虫、华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA为模板进行检测,评价该方法的特异性。将外源小分子DNA片段添加至人工尿液及健康人尿液后,经调整pH值、离心、浓缩等处理后,采用QIAmp Viral RNA Mini Kit （Qiagen试剂盒）、BIOG游离DNA 提取试剂盒（BIOG 试剂盒）提取尿液中的外源小分子DNA片段,比较不同处理方式及提取方法的效果。结果　成功制备81 bp外源日本血吸虫小分子DNA片段,建立的qPCR法最低能检测到100拷贝/μL的81 bp外源日本血吸虫小分子DNA片段。以上述7种寄生虫DNA为模板进行检测,仅日本血吸虫基因组DNA模板有荧光信号值增长。调整人工尿液pH值为5、6、7、8,采用Qiagen试剂盒提取其中的外源日本血吸虫小分子DNA片段回收率分别（49.12 ± 2.09）%、（84.52 ± 4.96）%、（89.38 ± 3.32）%和（87.82 ± 3.90）%;采用BIOG试剂盒提取小分子DNA片段回收率分别为（2.30 ± 0.07）%、（8.11 ± 0.26）%、（13.35 ± 0.61）%、（20.82 ± 0.68）%,两种方法提取回收率差异均有统计学意义（t = 38.702、26.955、39.042、29.571,P 均< 0.01）。采用Qiagen试剂盒提取人工尿液,pH值为5时核酸回收率最低（P均< 0.05）;pH值为6、7、8时,核酸回收率差异均无统计学意义（P均> 0.05）。人工尿液[（64.30 ± 1.00）% vs. （58.87 ± 0.26）%;t = 12.033,P < 0.05）]、健康人尿液[（31 165 ± 1 017）拷贝/μL vs.（28 471 ± 818 ）拷贝/μL;t = 23.164,P < 0.05]经离心后,外源小分子DNA片段回收效果均降低;使用10K离心浓缩管浓缩人工尿液、使用100K离心浓缩管浓缩健康人尿液均能有效提高Qiagen试剂盒回收效果（P均< 0.01）。结论　成功建立了尿液中外源日本血吸虫小分子DNA片段的提取方法,Qiagen试剂盒提取效果较好。将尿液样本pH值调整至6～8、使用100K离心浓缩管浓缩健康人尿液样本均可提高提取效果。