蛋白酶体抑制剂MG132对姜黄素诱导K562和Raji细胞HDAC1、P300表达的研究

近年来的研究显示泛素-蛋白酶体通路在细胞组蛋白乙酰化、去乙酰化的调控中发挥了重要的作用.有研究报道姜黄素可抑制肿瘤细胞增殖,影响细胞周期,姜黄素可通过调节组蛋白乙酰化、去乙酰化而发挥其作用.我们通过探讨姜黄素和蛋白酶抑制剂MG132联含姜黄素作用K562细胞、Raji细胞对组蛋白乙酰化酶（HDAC1）、P300蛋白的影响进一步明确了姜黄素发挥作用是否是通过泛素-蛋白酶体通路.     

雷公藤内酯醇对人淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察雷公藤内酯醇对人淋巴瘤细胞系Raji细胞体外增殖和细胞凋亡的影响。方法:实验于2005-04/11在华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所实验室完成。①人淋巴瘤细胞系Raji(中国科学院上海生物细胞研究所)。雷公藤内酯醇(Sigma公司)分子式C20H24O6,相对分子量360.4,纯度99%,用二甲基亚砜稀释,微孔滤膜(0.22μm)除菌,等量分装,-20℃保存,使用前解冻。②将Raji细胞放入RPMI-1640培养基中常规培养,每48h换液传代1次。实验前24h半量换液,取处于对数生长期、细胞活性大于98%的细胞进行实验。③采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测雷公藤内酯醇对Raji细胞增殖的影响。将Raji细胞按2×108L-1接种于96孔培养板,200μL/孔。实验共分5组:雷公藤内酯醇12.5,25,50,100nmol/L浓度组分别加入适量雷公藤内酯醇使其终浓度为12.5,25,50,100nmol/L,空白对照组未加入雷公藤内酯醇,5个平行孔/组。分别于培养12,24,48,72h后每孔加入5g/L的四甲基偶氮唑蓝20μL继续培养。用全自动酶标仪测定490nm波长处吸光度值。细胞增殖抑制率(%)=(1-雷公藤内酯醇各浓度组吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%。④采用AnnexinV/PI双标流式细胞术检测雷公藤内酯醇对Raji细胞凋亡的影响。将Raji细胞按2×108L-1接种于6孔培养板,实验分组同上,分别于孵育24,48h后收集细胞,调整各组细胞数为2×108L-1。取195μL细胞悬液,加入异硫氰酸荧光素标记的AnnexinV室温孵育,洗涤后加入碘化丙锭5μL,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:①雷公藤内酯醇对Raji细胞增殖的影响:不同浓度的雷公藤内酯醇对人淋巴瘤细胞系Raji的增殖均具有抑制作用,且呈时效和量效关系。与空白对照组比较,培养12,24,48,72h后雷公藤内酯醇12.5,25,50,100nmol/L浓度组的细胞增殖抑制率均明显升高(t=18.314～77.366,P均<0.01),培养24h时的半数抑制浓度为43.06nmol/L。②雷公藤内酯醇对Raji细胞凋亡的影响:经雷公藤内酯醇作用后,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,Raji细胞凋亡率逐渐增高,且呈时效和量效关系。与空白对照组比较,培养24,48h后雷公藤内酯醇12.5,25,50,100nmol/L浓度组的细胞凋亡率均明显升高(t=-23.657～-37.895,P均<0.05)。结论:雷公藤内酯醇对人淋巴瘤细胞系Raji细胞具有明显的生长抑制作用及诱导凋亡发生,且存在浓度和时间依赖关系。提示雷公藤内酯醇可能通过诱导细胞凋亡来有效抑制人淋巴瘤细胞的增殖,从而有望为治疗淋巴瘤提供新的策略。     

免疫因子对慢性免疫性血小板减少性紫癜骨髓巨核祖细胞体外生长的影响

目的 :探讨慢性免疫性血小板减少性紫癜 (CITP)骨髓巨核祖细胞生长成熟与免疫因素的关系。方法 :通过巨核祖细胞体外培养 ,观察CITP骨髓巨核祖细胞生长和成熟情况 ,并观察抗CD80抗体及干扰素α 2b(IFN α 2b)对CITP和对照组巨核祖细胞生长和成熟的影响 ,并与对照组比较。结果 :①CITP组的各种集落数(CFU MK、BFU MK、mCFU MK)均低于对照组 ,两组间集落数的均值比较差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。CITP组的直径和面积均低于对照组 ,两组间直径和面积均值比较差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。②加入抗CD80抗体的CITP的巨核祖细胞集落生成数明显增多 (P <0 .0 5 )。③IFN α 2b对两组的总集落均有抑制 ,CITP比对照组的巨核祖细胞集落生成受抑制程度低 (P <0 .0 5 )。结论 :CITP巨核祖细胞的集落生成和成熟度较低。抗CD80抗体和IFN α 2b对CITP巨核祖细胞的集落形成均有影响     

曲古菌素A对HL-60细胞组蛋白乙酰化水平和凋亡的作用

本研究旨在探讨曲古菌素A(trichostatinA ,TSA)高效低毒的抗癌机理。应用细胞培养、MTT法 ,免疫细胞化学技术和Annexin V FITC PI双标流式细胞术观察TSA对HL 6 0细胞和正常人外周血单个核细胞 (normalhumanperipheralbloodmononuclearcell,NPBMNC)的生长抑制 ,组蛋白乙酰化水平以及诱导凋亡的影响。结果表明 :TSA能够以时间、剂量依赖性方式抑制HL 6 0细胞增殖 ,36小时IC50 为 10 0ng ml。TSA能够诱导HL 6 0细胞凋亡 ,其作用也呈时间、剂量依赖性。TSA在显著诱导HL 6 0细胞凋亡的浓度和时间范围内对NPBMNC无明显的诱导凋亡作用。TSA处理 4小时后 ,HL 6 0细胞和NPBMNC组蛋白乙酰化水平上调显著高于未用TSA各组 (P<0 .0 5 ) ,但两者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :TSA对HL 6 0细胞有明确的抑制增殖能力 ;TSA有明确的诱导HL 6 0细胞凋亡的能力 ,这可能是TSA体外抑制白血病细胞系HL 6 0生长和发挥抗白血病作用的主要机理之一 ;与NPBMNC相比较 ,TSA能够选择性诱导HL 6 0细胞凋亡 ;TSA选择性抑制HL 6 0细胞的机理与TSA调控HL 6 0细胞和NPBMNC组蛋白乙酰化水平的差异无关。     

鱼藤素对U937细胞细胞周期及核孔蛋白Nup98和Nup88的调控作用

目的研究鱼藤素对人类白血病细胞株U937细胞体外抗肿瘤作用，研究其引起细胞周期与核孔蛋白Nup98和Nup88的改变，探讨其抗癌作用的分子机制。方法采用MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期分布，激光共聚焦显微镜检测Nup98和Nup88蛋白表达变化，免疫电镜和流式细胞术观测鱼藤素对Nup98和Nup88的调控，Western blot检测鱼藤素对U937细胞Nup98和Nup88蛋白表达的影响。结果①鱼藤素对U937细胞具有明显的增殖抑制作用，其抑制作用呈时间和剂量依赖性。②鱼藤素作用U937细胞后细胞周期发生变化，0、5、10、20、40、80nmol／L鱼藤素处理U937细胞24h，主要使细胞阻滞于S期和G2／M期，而G1／G0期细胞呈浓度依赖性降低。G1／G0期细胞比例依次为73．01％、71．15％、68．42％、52．45％、43．99％和22．82％，S期细胞比例依次为17．18％、16．30％、18．09％、27．56％、31．21％和46．85％，G2／M期细胞比例依次为9．75％、12．31％、13．09％、18．99％、24．83％和27．79％。③鱼藤素可以调节U937细胞Nup98和Nup88的表达，低浓度即可使Nup98表达上调，而使Nup88表达下调。结论鱼藤素能够抑制U937细胞增殖，使细胞阻滞于S期和G2／M期，而G1/G0期细胞呈浓度依赖性降低。其抗肿瘤机制可能通过参与调控U937细胞Nup98和Nup88的表达，使Nup98表达上调，而使Nup88表达下调有关。     

冬凌草甲素对多发性骨髓瘤细胞细胞周期和凋亡的影响及其机制研究

目的探讨冬凌草甲素(oridonin,Ori)对人多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响及其涉及机制。方法利用MTT比色法检测Ori对细胞增殖活性的影响;碘化丙啶(PI)单染流式细胞术检测细胞周期;TUNEL法检测细胞凋亡;Western blot技术检测p65核蛋白水平。结果 Ori能明显抑制RPMI 8226细胞增殖,其抑制作用呈时间、剂量依赖性;能同时引起细胞G2/M细胞周期阻滞、细胞凋亡和p65核蛋白水平下降;吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)抑制核因子κB(NF-κB)活性后进一步促进了Ori所致的细胞G2/M细胞周期阻滞和凋亡。结论 Ori能明显抑制RPMI 8226细胞增殖,引起G2/M细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,该效应与NF-κB活性抑制相关。     

Effect of N-tosyl-L-phenylalanylchloromethyl Ketone on Tumor Necrosis Factor-alpha -induced NF-κB Activation and Apoptosis in U937 Cell Line

Summary: To investigate the effect of N-tosyl-L-phenylalanylchloromethyl ketone (TPCK) on tumor necrosis factor-alpha-induced NF-κB activation and apoptosis in U937 cell line, changes and subcellular localization of NF-κB/p65 and IκB-α were observed by fluorescencemicroscopy and expression and degradation of IκB-α by flow cytometry. The apoptosis of U937 cells was measured by flow cytometry and electrophoresis of DNA. Immunolfluorescence assay showed that NF-κB/p65,IκB-α only localized in cytoplasm. After TNF-α stimulation, p65 was localized only in nuclei, and IκB-α was only localized in cytoplasm and decreased. The changes of TNF-α stimulation were specifically inhibited by TPCK. Flow cytometry also revealed the downregulation of IκB-α protein during TNF-α-induced apoptosis and the down-regulation was specifically inhibited by TPCK. Flow cytometry also showed the apoptosis of U937 cells after TNF-α induction. DNA ladder can be detected in cells treated by TNF-α. It is concluded that degradation of IκB-α protein and NF-κB/p65 translocation occur during TNF-α-induced apoptosis of U937 cells, suggesting the activation of NF-κB.TPCK-sensitive protease plays an important role in the degradation of IκB-α protein induced by TNF-α in U937 cells. TPCK sensitive protease also plays an important role in the apoptosis of U937 cells induced by TNF-α.     

Effects of Gambogic Acid on the Regulation of Nucleoporin Nup88 in U937 Cells

In order to investigate the anti-leukemia effects of gambogic acid （GA） and its relation to the regulation of nucleoporin Nup88 in U937 cells in vitro, the inhibitory effect of GA on the growth of U937 cells was examined by using MTT assay. Apoptosis was detected by Annexin-V FITC/PI double-labeled cytometry. Cell cycle regulation was studied by propidium iodide method. Both flow cytometry （FCM） and RT-PCR were employed to assess the expression of Nup88, and the localization of Nup88 was determined by confocal microscopy. The results indicated that GA had strong inhibitory effect on cell proliferation and apoptosis induction activity in U937 cells in vitro in a time-and dose-dependent manner. The 24-h IC50 value was （1.019±0.134） mg/L. Moreover, GA induced arrest of U937 cells in G0/G1 phase. Over-expression of Nup88 was found in U937 cells, whereas GA could significantly down-regulate both the protein and mRNA levels of Nup88. Nup88 was diffusely distributed between nucleus and cytoplasm and was located at the cytoplasmic side of nuclear rim, and occasionally in cytoplasm. It is suggested that GA exerts its anti-leukemia effects by regulating the expression and distribution of nucleoporin Nup88. It promises to be new agent for the treatment of acute leukemia.     

肿瘤坏死因子α对Raji细胞Notch1蛋白表达的影响

目的 通过探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)作用淋巴瘤细胞系Raji细胞后Notch1蛋白表达的变化,进一步明确TNF-α对淋巴瘤细胞Notch信号途径的影响.方法 采用半定量RT-PCR方法检测Raji细胞Notch1 mRNA的含量;用流式细胞术分析Raji细胞Notch1蛋白的表达及TNF-α作用后Notch1蛋白的变化.结果 ①半定量RT-PCR检测结果表明Raji细胞经TNF-α作用后Notch1 mRNA的含量明显增高,且随TNF-α浓度的增加而增高,与对照组比较,差异有极显著性意义(P<0.01);②流式细胞术分析表明,Notch1蛋白在Raji细胞呈阳性表达,TNF-α作用组Notch1蛋白的平均荧光强度明显高于对照组,差异亦有极显著性意义 (P<0.01).结论 TNF-α可上调Raji细胞内Notch1蛋白的表达;TNF-α可通过影响Notch信号途径在淋巴瘤细胞内发挥作用.