刺激物洗脱对马兜铃酸-Ⅰ所致肾小管上皮细胞增殖抑制作用的影响

目的 以体外培养的人近端肾小管上皮细胞系（HK-2）为研究对象,探讨刺激物马兜铃酸-Ⅰ被洗脱（aristolochic acid-Ⅰ,AA-Ⅰ）后对HK-2细胞增殖抑制作用的影响.方法 以AA-Ⅰ分别刺激细胞12、24、48h后去除刺激物,加入Hank＇＇s液对细胞进行重复3次洗涤,继续培养24h后测定各项指标.台盘兰染色后细胞计数法观察存活细胞增殖反应;流式细胞仪分析细胞周期变化情况.结果 应用AA-Ⅰ（10 μg/ml）刺激HK-2细胞后,随着刺激时间的延长存活细胞数量逐渐减少,12、24、48h后存活细胞计数较对照组分别下降8%、25%和57%;细胞周期测定结果显示AA-Ⅰ刺激HK-2细胞后,G2/M期细胞比例逐渐增高,到24h后G2/M期比例达对照组的1.28倍,48h后达正常对照组的3.8倍.以上情况在洗脱以后并没有得到改善,表现为洗脱后的12、24、48h组细胞数较相应时间点的刺激组分别下降45%、32%和30%;AA的G2/M阻滞作用在洗脱以后也没有好转,洗脱24h组G2/M比例达AA24h组的2.91倍,而与AA48h组差异无显著性.结论 AA-Ⅰ（10 μg/mi）能够显著抑制HK-2细胞的增殖,表现为细胞数目减少,细胞周期阻滞于G2/M期.洗脱细胞外的AA-Ⅰ后并未能改善AA-Ⅰ刺激导致的细胞增殖抑制作用,提示细胞内蓄积的AA-Ⅰ或其代谢物可能是导致细胞持续损伤的主要原因.     

马兜铃内酰胺-Ⅰ进入人肾小管上皮细胞及细胞内分布和蓄积的观察

目的:观察马兜铃内酰胺-Ⅰ(AL-Ⅰ)能否进入肾小管上皮细胞及其在细胞内的分布、蓄积情况。方法:以体外培养的人类近端肾小管上皮细胞系(HK-2)为研究对象,用不同质量浓度的AL-Ⅰ(5～20μg.mL^-1)处理细胞,采用荧光倒置显微镜观察细胞内由AL-Ⅰ产生荧光的有无及其分布,并在洗去含AL-Ⅰ的培养液后继续培养HK-2细胞48h,观察细胞内AL-Ⅰ荧光的持续情况以判断其蓄积性。结果:不同质量浓度的AL-Ⅰ(5～20μg.mL^-1)处理细胞0.5h内,均能在肾小管上皮细胞内观察到蓝绿色的AL-Ⅰ荧光,并且荧光仅分布于细胞浆中,而在细胞核内未观察到。在洗去含AL-Ⅰ培养液后继续培养时AL-Ⅰ的荧光可在细胞内持续存在48h以上,其持续存在部位仍为细胞浆。结论:AL-Ⅰ可以在短时间内迅速进入肾小管上皮细胞,其分布部位在细胞浆,不进入细胞核;AL-Ⅰ在细胞浆内的蓄积可能与其致肾损伤的毒性作用机制有关,即通过进入肾细胞并蓄积于细胞内在肾病过程中持续发挥毒性作用。     

丝裂素活化蛋白激酶信号转导途径对血小板源生长因子所致鼠肾系膜细胞表型转化的调控作用

目的 研究血小板源生长因子（PDGF）对肾小球系膜细胞（MC）表型转化的影响,并探讨丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号转导途径在其作用中的调控机制。方法 以体外培养的大鼠MC为对象,观察PDGF对细胞增殖、α-平滑肌肌动蛋白（SMA）表达和细胞内c-Jun氨基末端激酶（JNK）活性的作用;观察细胞外信号调节激酶（ERK）途径上游信号MEK-1阻断剂PD98059对PDGF所致上术作用的影响;应用raf-1基因转染并稳定高表达的MC观察其对α-SMA表达,细胞形态及其超微结构的影响。结果 PDGF可刺激MC持续增殖;刺激6～48h可使α-SMA表达增加,但持续刺激72h以上则可导致其表达被抑制近50%,PDGF对JNK活性无明显影响,阻断ERK活化不影响JNK活性及PDGF对α-SMA表达的短时刺激作用。Raf-1蛋白激酶稳定高表达的MC细胞内α-SMA表达缺失,同时细胞内微丝、微管结构减少,细胞形态改变。结论 PDGF对系膜细胞表型转化的影响表现为促进细胞持续增殖、短时作用刺激α-SMA表达而持续作用则抑制α-SMA表达,提示其为具有调控MC增殖和分化双重作用的细胞因子。PDGF的作用可能与MAPK不同亚类的调控有关,其中Raf-1和JNK活性可能对细胞表型具有关键调控作用。     

急性马兜铃酸肾损伤大鼠血清分泌型磷脂酶A2的变化

目的 通过测定急性马兜铃酸肾损伤大鼠血清分泌型磷脂酶A2（sPLA2）活性的变化,探讨sPLA2在马兜铃酸肾病（AAN）发病机制中的作用。 方法 将Wistar大鼠按随机数字表法分为两组：模型组给予关木通水煎剂（相当于生药30 g&#8226;kg-1&#8226;d-1）灌胃7 d,停药后正常喂养至第14天;对照组以自来水灌胃。光镜观察肾脏病理变化并用半定量方法评价肾小管间质损伤程度;生化法测定肾小球及肾小管功能;巯基显色法分别检测血清sPLA2活性;Western印迹法测定肾皮质和肾髓质环氧化酶2（COX-2）蛋白表达;放射免疫法分别测定血清和尿液中前列腺素类（PGs）代谢产物6-keto-PGF1α与血栓烷B2（TXB2）水平并计算二者的比值。 结果 给药后模型组大鼠出现明显的肾小管间质损伤和肾功能下降,并在第8天达高峰,肾小管间质损伤指数（8.14±2.55）较对照组（1.50±0.71）显著升高（P < 0.05）,Scr水平显著增高[（0.24±0.10）比（0.19±0.02） μmol/g,P < 0.05]。给药第8天时模型组血清中sPLA2活性（μmol&#8226;min-1&#8226;mg-1）（133.15±17.05）较对照组（101.3±16.07）显著增强（P < 0.05）,同时肾皮质COX-2蛋白表达也显著增加（1.16±0.36 比0.69±0.28,P < 0.05）,但肾髓质的COX-2蛋白表达无变化。尽管模型组血清中6-keto-PGF1α、TXB2及其比值无变化,但其尿液中6-keto-PGF1α和TXB2水平显著升高,分别为对照组的2倍和3倍（P < 0.05）,二者的比值显著降低（207.53±17.52比296.64±51.31,P < 0.05）。上述变化除肾小管间质损伤指数外,均在第14天时恢复,与对照组差异无统计学意义。 结论 在急性马兜铃酸肾损伤大鼠模型中,血清sPLA2呈激活状态,伴随出现的肾皮质COX-2表达增加及尿液中缩血管类PGs代谢产物增加,提示肾脏缩血管反应增强,可能是马兜铃酸肾损害时组织缺血改变的机制之一。     

血管紧张素Ⅱ对肾系膜细胞丝裂原活化蛋白激酶的作用

血管紧张素Ⅱ对肾系膜细胞丝裂原活化蛋白激酶的作用唐嘉薇李晓玫（北京医科大学第一医院肾内科肾脏病研究所，北京１０００３４）血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）是一类重要的血管活性物质，在体外研究中发现，它可引起肾小球系膜细胞（ＭＣ）收缩并调节肾小球血流量，还可调...     

外源性表皮生长因子对马兜铃酸-Ⅰ所致细胞增殖抑制作用的影响

目的：探讨加入外源性表皮生长因子(EGF)能否改善马兜铃酸-Ⅰ(AA-Ⅰ)引起的细胞增殖抑制作用。方法：以体外培养的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)为研究对象，在正常培养组(对照组)、AA-Ⅰ(10 mg·L^-1)刺激组(AA组)和不同时机加入EGF处理组之间比较各项指标变化;用倒置显微镜对细胞形态进行观察；台盼蓝染色后细胞计数法观察细胞增殖反应；流式细胞仪分析细胞周期变化情况。结果：与对照组相比，AA-Ⅰ对细胞的毒性作用呈浓度和时间依赖性增强，AA-Ⅰ(10 mg·L^-1)刺激24，48 h后对存活细胞的细胞周期分析可见G₀/G₁期细胞比例分别减少31.4%和87.4%，而G₂/M期细胞比例逐渐增高达对照的1.32倍和3.73倍(均P<0.05)。EGF(20 μg·L^-1)刺激24 h后细胞数达对照组的1.36倍(P<0.05)，细胞周期中G₀/G₁期细胞比例减少9.7%，S和G₂/M期细胞比例分别增高2.9%和6.7%，表明EGF具有促进细胞周期的作用。与AA-Ⅰ组相比，无论预先(preEGF)、同时(EGF)或刺激后(postEGF)加入EGF，AA-Ⅰ所致的细胞增殖抑制现象并没有得到改善，也未能明显改善其导致的细胞周期异常。结论：AA-Ⅰ(10 mg·L^-1)能够显著抑制损伤后存活HK-2细胞的增殖，使细胞周期阻滞于G₂/M期；外源性EGF(20 μg·L^-1)能够明显促进正常细胞增殖，但不同时机加入EGF均不能改善AA-Ⅰ所致的细胞增殖抑制作用。     

黄芪当归合剂抑制马兜铃酸Ⅰ导致的肾小管上皮细胞损伤

目的:探讨黄芪当归合剂(astragalus and angelica mixture, A&A)对外源性马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ, AA-Ⅰ)所造成的肾小管上皮细胞损伤的干预作用.方法:以体外培养的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)为研究对象,在AA-I(2.5 mg/L)刺激细胞4 h后,给予A&A药物血清并使细胞继续生长至48 h,应用流式细胞仪分析细胞DNA含量了解细胞凋亡情况;采用 ELISA法检测细胞培养上清液中纤维连接蛋白(fibronectin, FN)及转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)分泌水平;比较A&A 干预前后AA-I诱导的细胞凋亡、TGF-β1及FN分泌的改变. 结果:正常HK-2细胞能够分泌少量TGF-β1(7.05±1.98 μg/L),正常血清与A&A 均不能够诱导TGF-β1的明显分泌(6.35±1.99 μg/L and 6.57±2.19 μg/L, vs. 对照组, P＞0.05),AA-Ⅰ能够诱导细胞分泌TGF-β1(18.26±5.98 μg/L, vs. 对照组, P＜0.05),与AA-I作用组相比,A&A能够抑制TGF-β1分泌(6.66±0.70 μg/L, vs. AA-I, P＜0.05),抑制率达63.5%;A&A还能够阻断细胞凋亡,阻断率达93.7%(3.32%±0.41% vs. 19.19±6.32%,A&A+AA-I vs. AA-I, P＜0.001),并能抑制AA-I诱导HK-2细胞分泌(1.64±1.11倍vs. 2.93±0.87倍, P＜0.05),抑制率达44%.结论:A&A能够减轻AA-Ⅰ诱导的肾小管上皮细胞损伤,其机制可能与抑制TGF-β1的作用有关.     

黄芪当归合剂对间质纤维化肾脏中细胞外基质降解系统的调控作用

目的:深入研究黄芪当归合剂抑制肾脏纤维化的作用机制。方法:Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、单侧输尿管梗阻模型组和黄芪当归合剂治疗组(14 g.kg-1.d-1)。在治疗后的第3,7,10天观察各组纤维化程度,测定纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及活性PAI-1,t-PA的表达,检测基质金属蛋白酶(MMP-9,MMP-2)及组织型基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)活性。结果:黄芪当归合剂明显减轻输尿管梗阻导致的肾间质纤维化。在各时间点,模型组总PAI-1及活性PAI-1的表达较假手术组明显增高,而经黄芪当归合剂治疗后PAI-1表达及活性较模型组显著降低;模型组中t-PA仅在第3天时增高,同时黄芪当归合剂治疗组较模型组明显降低。整个观察期中模型组和黄芪当归合剂治疗组的MMP-2,9活性均较假手术组明显增高,但2组间无统计学差异;模型组的TIMP-1活性在第7天和第10天时显著增高,而黄芪当归合剂治疗组较模型组显著降低。结论:黄芪当归合剂可以改善肾组织PAs/PAIs及MMPs/TIMPs系统的失衡而减少细胞外基质的积聚,可能是其抑制肾间质纤维化的机制之一。